Underpopulationer af immunceller i influenza A- og B-patienter

Baggrund:

I slutningen af ​​marts og begyndelsen af ​​april 2009 blev et udbrud af en ny influenzavirus betegnet A/H1N1-influenza (populært kendt som svineinfluenza) rapporteret i Mexico, med efterfølgende tilfælde observeret i mange lande, hvilket førte til Verdenssundhedsorganisationens erklæring om en verdensomspændende pandemi.

Det første tilfælde af influenza A/H1N1 i Israel blev diagnosticeret i slutningen af ​​april 2009 på Laniado Hospital hos en ung mand, der vendte tilbage fra Mexico.

Influenza A/H1N1 (svineinfluenza) har en relativt høj sygelighed, især hos unge patienter. Tidlig identifikation vil muliggøre hurtig påbegyndelse af behandlingen og derved forbedre resultaterne.

I 2009, under H1N1-pandemien i Israel, blev der udført en forskning i vores afdeling for pædiatri. Forskerne Sharon et al. (1) har sammenlignet en gruppe på 53 børn inficeret med influenza A H1N1 med en gruppe på 53 børn, der havde influenzasymptomer, men som blev fundet negative for virussen. Denne sammenligning viste en signifikant reduktion i lymfocyttal i den akutte fase af sygdommen (dag 1-3) med opløsning på dag 7 (6-9) samt reduktion i neutrofiltal på dag 5 fra begyndelsen af ​​høj feber med efterfølgende opløsning 2-4 dage senere (dage 7-10). Dette fænomen blev ikke observeret hos patienter, der ikke var inficeret med H1N1-virus. Lignende resultater blev rapporteret af Cao og medforfattere (2), der observerede det hos både pædiatriske og voksne patienter. Lewis et al foreslog, at lymfopenien hovedsageligt skyldes reduktion i T-celler og i mindre grad i B-celler (3). Den typiske lymfopeni for influenza A H3N3 under akut sygdom viste sig at skyldes en reduktion i både T- og B-celler uden ændring i CD4:CD8-forholdet. Dette er i modsætning til resultaterne af Cao et al. (2) som bemærkede et unormalt CD4:CD8-forhold hos halvdelen af ​​dem, der var positive for A H1N1. En af de mulige forklaringer som foreslået af Nichols og Collaborators (4) er, at tidlig lymfopeni og den senere neutropeni hos de influenzainficerede patienter kan repræsentere migration af disse celler fra kredsløbet til de inficerede luftveje som følge af infektion. Mål med vores forskning At kvantificere B-, T- og NK-populationerne af lymfocytter under forskellige stadier af sygdommen forårsaget af Infuenza A H1N1.

Undersøgelsesmetoder Undersøgelsens emner var børn, der var indlagt på vores afdeling med tegn og symptomer på influenza. Deltagernes forældre eller værger har underskrevet et skriftligt samtykke. I det første trin blev der taget en podepind fra øvre luftveje for at bestemme tilstedeværelsen af ​​Infuenza A H1N1 (virusidentifikationen blev udført ved RT - PCR). Derefter blev de forskellige undertyper af lymfocytter kvantificeret på forskellige stadier af sygdommen. Identifikationen og kvantificeringen af ​​de forskellige celletyper blev udført ved FACS-metoden, cellereceptorerne, der blev markeret, var CD31, CD19, CD4, CD3, CD45, CD8, CD56.

Laboratorieteknik:

Cellulære markører blev vurderet ved flowcytometri. Cellefarvning blev udført på enkeltcellesuspensioner under anvendelse af forafkølet PBS i 5 ml FACS-rør. Vasketrin blev udført ved centrifugering i 5 minutter, 300 g, 5°C, bremse 5, hvorefter supernatanter blev fuldstændigt pipetteret af og cellepelleter (typisk indeholdende 0,2-1,0×106 celler) blev resuspenderet i 100 μl PBS (uden Ca++ og Mg++) suppleret med 0,5 % bovint serumalbumin, farvet med specifikke fluorochrom-konjugerede anti-humane antistoffer eller isotype-matchede ikke-specifikke kontroller og inkuberet i køleskabet 2 -8°C i 30 min. Efter inkubation blev celler vasket ved centrifugering og resuspenderet i 0,25-0,5 ml koldt PBS.

De testede celler blev farvet med muse monoklonale antistoffer for CD45-FITC, CD45-PE en panleukocytmarkør, T-cellemarkør CD3-PE CD8-FITC, T-hjælperceller CD4-FITC, CD8-PE, Natural killer (NK) cellemarkør CD56 -PE, monocytmarkør CD31-FITC og B-cellemarkør CD19-PE.

Emissionskompensation blev udført af positive kontrolrør indeholdende celler, der var farvet med CD45-FITC eller CD45-PE; Døde celler blev udelukket ved farvning med 7-aminoactinomycin D, kun ikke-farvede levedygtige celler blev analyseret. Mindst 10.000 cellulære hændelser pr. prøve blev analyseret ved hjælp af CellQuest Pro- eller FlowJo-softwaren. Procentandele af isotypekontrolantistoffarvning, der ikke overstiger 1 % farvede celler, blev brugt til at indstille de 'positive' farvningsporte og blev udledt fra de specifikke antistofresultater. Resultaterne er udtrykt som procentdelen af ​​farvede celler.