Unterpopulationen von Immunzellen bei Influenza-A- und -B-Patienten

Hintergrund:

Ende März und Anfang April 2009 wurde in Mexiko ein Ausbruch eines neuartigen Influenzavirus mit der Bezeichnung A/H1N1-Influenza (allgemein bekannt als Schweinegrippe) gemeldet, wobei weitere Fälle in vielen Ländern beobachtet wurden, was zur Erklärung der Weltgesundheitsorganisation führte, dass a weltweite Pandemie.

Der erste Fall von Influenza A/H1N1 in Israel wurde Ende April 2009 im Krankenhaus Laniado bei einem jungen Mann diagnostiziert, der aus Mexiko zurückkehrte.

Influenza A/H1N1 (Schweinegrippe) trägt eine relativ hohe Morbidität, insbesondere bei jungen Patienten. Eine frühzeitige Erkennung würde einen sofortigen Beginn der Therapie ermöglichen und dadurch die Ergebnisse verbessern.

Im Jahr 2009, während der H1N1-Pandemie in Israel, wurde in unserer Abteilung für Pädiatrie eine Untersuchung durchgeführt. Die Forscher Sharon et al. (1) haben eine Gruppe von 53 Kindern, die mit Influenza A H1N1 infiziert waren, mit einer Gruppe von 53 Kindern verglichen, die Grippesymptome aufwiesen, aber für das Virus negativ befunden wurden. Dieser Vergleich zeigte eine signifikante Verringerung der Lymphozytenzahl während der akuten Phase der Erkrankung (Tage 1–3) mit Abklingen am Tag 7 (6–9) sowie eine Verringerung der Neutrophilenzahl am Tag 5 ab dem Beginn des hohen Fiebers anschließende Auflösung 2-4 Tage später (Tage 7-10). Dieses Phänomen wurde bei Patienten, die nicht mit dem H1N1-Virus infiziert waren, nicht beobachtet. Ähnliche Ergebnisse wurden von Cao und Co-Autoren (2) berichtet, die es sowohl bei pädiatrischen als auch bei erwachsenen Patienten beobachteten. Lewis et al. schlug vor, dass die Lymphopenie hauptsächlich auf eine Verringerung der T-Zellen und in geringerem Maße auf die B-Zellen zurückzuführen ist (3). Es wurde gezeigt, dass die für Influenza A H3N3 während einer akuten Erkrankung typische Lymphopenie auf eine Verringerung sowohl der T- als auch der B-Zellen ohne Veränderung des CD4:CD8-Verhältnisses zurückzuführen ist. Dies steht im Gegensatz zu den Ergebnissen von Cao et al. (2) die bei der Hälfte der A H1N1-positiven Patienten ein anormales CD4:CD8-Verhältnis feststellten. Eine der von Nichols und Collaborators (4) vorgeschlagenen möglichen Erklärungen ist, dass die frühe Lymphopenie und die spätere Neutropenie bei den Influenza-infizierten Patienten eine Migration dieser Zellen aus dem Kreislauf in die infizierten Atemwege als Folge der Infektion darstellen können. Ziele unserer Forschung Quantifizierung der B-, T- und NK-Populationen von Lymphozyten während verschiedener Stadien der durch Infuenza A H1N1 verursachten Krankheit.

Studienmethoden Die Studienteilnehmer waren Kinder, die in unserer Abteilung mit Anzeichen und Symptomen einer Grippe ins Krankenhaus eingeliefert wurden. Die Eltern oder Erziehungsberechtigten der Teilnehmer haben eine schriftliche Einverständniserklärung unterzeichnet. Im ersten Schritt wurde ein Abstrich der oberen Atemwege entnommen, um das Vorhandensein von Infuenza A H1N1 festzustellen (der Virusnachweis erfolgte mittels RT-PCR). Dann wurden die verschiedenen Subtypen von Lymphozyten in verschiedenen Krankheitsstadien quantifiziert. Die Identifizierung und Quantifizierung der verschiedenen Zelltypen wurde durch die FACS-Methode durchgeführt, die markierten Zellrezeptoren waren CD31, CD19, CD4, CD3, CD45, CD8, CD56.

Labortechnik:

Zelluläre Marker wurden durch Durchflusszytometrie bewertet. Die Zellfärbung wurde an Einzelzellsuspensionen unter Verwendung von vorgekühltem PBS in 5 ml FACS-Röhrchen durchgeführt. Waschschritte wurden durch Zentrifugation für 5 min, 300 g, 5 °C, Bremse 5 durchgeführt, wonach die Überstände vollständig abpipettiert und Zellpellets (typischerweise enthaltend 0,2-1,0 × 106 Zellen) wurden in 100 μl PBS (ohne Ca++ und Mg++), ergänzt mit 0,5 % Rinderserumalbumin, resuspendiert, mit spezifischen Fluorochrom-konjugierten Anti-Human-Antikörpern oder Isotyp-angepassten unspezifischen Kontrollen gefärbt und im Kühlschrank inkubiert 2 -8°C für 30 min. Nach der Inkubation wurden die Zellen durch Zentrifugation gewaschen und in 0,25–0,5 ml kaltem PBS resuspendiert.

Die getesteten Zellen wurden mit monoklonalen Maus-Antikörpern für CD45-FITC, CD45-PE, einen Pan-Leukozytenmarker, T-Zellmarker CD3-PE, CD8-FITC, T-Helferzellen CD4-FITC, CD8-PE, natürlicher Killer (NK)-Zellmarker CD56 gefärbt -PE, Monozytenmarker CD31-FITC und B-Zellmarker CD19-PE.

Die Emissionskompensation wurde durch positive Kontrollröhrchen durchgeführt, die Zellen enthielten, die mit CD45-FITC oder CD45-PE gefärbt waren; Tote Zellen wurden durch Färben mit 7-Aminoactinomycin D ausgeschlossen, nur ungefärbte lebensfähige Zellen wurden analysiert. Mindestens 10.000 zelluläre Ereignisse pro Probe wurden mit der Software CellQuest Pro oder FlowJo analysiert. Prozentsätze der Isotyp-Kontrollantikörper-Färbung, die 1 % der gefärbten Zellen nicht überstieg, wurden verwendet, um die „positiven“ Färbe-Gates festzulegen, und wurden aus den spezifischen Antikörper-Ergebnissen abgeleitet. Die Ergebnisse werden als Prozentsatz gefärbter Zellen ausgedrückt.