Subpoblaciones de células inmunitarias en pacientes con influenza A y B

Antecedentes:

A fines de marzo y principios de abril de 2009, se notificó en México un brote de un nuevo virus de influenza denominado influenza A/H1N1 (conocido popularmente como gripe porcina), y se observaron casos posteriores en muchos países, lo que llevó a la declaración por parte de la Organización Mundial de la Salud de un pandemia mundial.

El primer caso de influenza A/H1N1 en Israel fue diagnosticado a fines de abril de 2009 en el Hospital Laniado en un joven que regresaba de México.

La influenza A/H1N1 (gripe porcina) conlleva una morbilidad relativamente alta, particularmente en pacientes jóvenes. La identificación temprana permitiría el inicio rápido de la terapia, mejorando así los resultados.

En 2009, durante la pandemia de H1N1 en Israel, se realizó una investigación en nuestro departamento de pediatría. Los investigadores Sharon et al. (1) han comparado un grupo de 53 niños infectados con Influenza A H1N1, con un grupo de 53 niños que presentaron síntomas gripales pero resultaron negativos para el virus. Esta comparación demostró una reducción significativa en el recuento de linfocitos durante la fase aguda de la enfermedad (días 1-3) con resolución en el día 7 (6-9) así como una reducción en el recuento de neutrófilos en el día 5 desde el inicio de la fiebre alta con resolución posterior 2-4 días después (días 7-10). Este fenómeno no se observó en los pacientes que no estaban infectados con el virus H1N1. Cao y coautores (2) informaron resultados similares que lo observaron en pacientes pediátricos y adultos. Lewis y otros sugirieron que la linfopenia se debe principalmente a la reducción de las células T y, en menor medida, de las células B (3). Se demostró que la linfopenia típica de la influenza A H3N3 durante la enfermedad aguda se debe a una reducción en las células T y B sin alteración en la relación CD4:CD8. Esto contrasta con los hallazgos de Cao et al. (2) que notó una proporción anormal de CD4:CD8 en la mitad de los que dieron positivo para A H1N1. Una de las posibles explicaciones propuesta por Nichols y colaboradores (4) es que la linfopenia temprana y la neutropenia posterior en los pacientes infectados por influenza pueden representar la migración de estas células desde la circulación hacia el tracto respiratorio infectado como consecuencia de la infección. Objetivos de nuestra investigación Cuantificar las poblaciones de linfocitos B, T y NK durante las diferentes etapas de la enfermedad causada por Infuenza A H1N1.

Métodos de estudio Los sujetos del estudio fueron niños hospitalizados en nuestro departamento con signos y síntomas de gripe. Los padres o tutores legales de los participantes han firmado un consentimiento por escrito. En la primera etapa se tomó un hisopado de vías respiratorias altas para determinar la presencia de Infuenza A H1N1 (la identificación del virus se hizo por RT - PCR). Luego se cuantificaron los diferentes subtipos de linfocitos en diferentes etapas de la enfermedad. La identificación y cuantificación de los diferentes tipos celulares se realizó por el método FACS, los receptores celulares que se marcaron fueron CD31, CD19, CD4, CD3, CD45, CD8, CD56.

Técnica de laboratorio:

Los marcadores celulares se evaluaron mediante citometría de flujo. La tinción celular se realizó en suspensiones de células individuales usando PBS preenfriado en tubos FACS de 5 ml. Los pasos de lavado se realizaron mediante centrifugación durante 5 min, 300 g, 5 °C, freno 5, después de lo cual los sobrenadantes se pipetearon por completo y los sedimentos celulares (que normalmente contenían 0,2-1,0 × 106 células) se resuspendieron en 100 μl de PBS (sin Ca++ ni Mg++) suplementado con albúmina de suero bovino al 0,5 %, se tiñeron con anticuerpos antihumanos conjugados con fluorocromos específicos o controles no específicos de isotipo coincidente y se incubaron en el refrigerador 2 -8°C durante 30 min. Después de la incubación, las células se lavaron por centrifugación y se resuspendieron en 0,25-0,5 ml de PBS frío.

Las células analizadas se tiñeron con anticuerpos monoclonales de ratón para CD45-FITC, CD45-PE un marcador panleucocitario, marcador de células T CD3-PE CD8-FITC, células T auxiliares CD4-FITC, CD8-PE, marcador de células asesinas naturales (NK) CD56 -PE, marcador de monocitos CD31-FITC y marcador de células B CD19-PE.

La compensación de emisiones se realizó mediante tubos de control positivo que contenían células teñidas con CD45-FITC o CD45-PE; Las células muertas se excluyeron mediante tinción con 7-aminoactinomicina D, solo se analizaron las células viables no teñidas. Se analizaron al menos 10 000 eventos celulares por muestra utilizando el software CellQuest Pro o FlowJo. Se usaron porcentajes de tinción de anticuerpos de control de isotipo, que no excedieron el 1% de células teñidas, para establecer las puertas de tinción 'positivas' y se dedujeron de los resultados de anticuerpos específicos. Los resultados se expresan como el porcentaje de células teñidas.