Sous-populations de cellules immunitaires chez les patients grippés A et B

Arrière plan:

Fin mars et début avril 2009, une éclosion d'un nouveau virus de la grippe appelé grippe A/H1N1 (plus connue sous le nom de grippe porcine) a été signalée au Mexique, avec des cas ultérieurs observés dans de nombreux pays, ce qui a conduit à la déclaration par l'Organisation mondiale de la santé d'une pandémie mondiale.

Le premier cas de grippe A/H1N1 en Israël a été diagnostiqué fin avril 2009 à l'hôpital Laniado chez un jeune homme revenant du Mexique.

La grippe A/H1N1 (grippe porcine) entraîne une morbidité relativement élevée, en particulier chez les jeunes patients. Une identification précoce permettrait une initiation rapide du traitement, améliorant ainsi les résultats.

En 2009, lors de la pandémie H1N1 en Israël, une recherche a été menée dans notre département de pédiatrie. Les chercheurs Sharon et al. (1) ont comparé un groupe de 53 enfants infectés par la grippe A H1N1, avec un groupe de 53 enfants qui présentaient des symptômes grippaux mais se sont révélés négatifs pour le virus. Cette comparaison a démontré une réduction significative du nombre de lymphocytes pendant la phase aiguë de la maladie (jours 1-3) avec résolution au jour 7 (6-9) ainsi qu'une réduction du nombre de neutrophiles au jour 5 dès le début de la forte fièvre avec résolution ultérieure 2 à 4 jours plus tard (jours 7 à 10). Ce phénomène n'a pas été observé chez les patients non infectés par le virus H1N1. Des résultats similaires ont été rapportés par Cao et ses co-auteurs (2) qui l'ont observé chez des patients pédiatriques et adultes. Lewis et al ont suggéré que la lymphopénie est principalement due à la réduction des lymphocytes T et, dans une moindre mesure, des lymphocytes B (3). Il a été démontré que la lymphopénie typique de la grippe A H3N3 au cours d'une maladie aiguë était due à une réduction des cellules T et B sans altération du rapport CD4:CD8. Cela contraste avec les conclusions de Cao et al. (2) qui ont noté un rapport CD4:CD8 anormal chez la moitié de ceux qui étaient positifs pour le A H1N1. L'une des explications possibles proposées par Nichols et ses collaborateurs (4) est que la lymphopénie précoce et la neutropénie ultérieure chez les patients infectés par la grippe peuvent représenter la migration de ces cellules de la circulation vers les voies respiratoires infectées à la suite de l'infection. Objectifs de notre recherche Quantifier les populations de lymphocytes B, T et NK aux différents stades de la maladie causée par l'Infuenza A H1N1.

Méthodes d'étude Les sujets de l'étude étaient des enfants hospitalisés dans notre service avec des signes et symptômes de grippe. Les parents ou tuteurs légaux des participants ont signé un consentement écrit. Au premier stade, un écouvillonnage des voies respiratoires supérieures a été effectué pour déterminer la présence d'Infuenza A H1N1 (l'identification du virus a été effectuée par RT - PCR). Ensuite, les différents sous-types de lymphocytes ont été quantifiés à différents stades de la maladie. L'identification et la quantification des différents types cellulaires ont été réalisées par la méthode FACS, les récepteurs cellulaires qui ont été marqués étaient CD31, CD19, CD4, CD3, CD45, CD8, CD56.

Technique de laboratoire :

Les marqueurs cellulaires ont été évalués par cytométrie en flux. La coloration cellulaire a été réalisée sur des suspensions de cellules individuelles en utilisant du PBS pré-refroidi dans des tubes FACS de 5 ml. Les étapes de lavage ont été effectuées par centrifugation pendant 5 min, 300 g, 5 ° C, frein 5, après quoi les surnageants ont été complètement pipetés et les culots cellulaires (contenant généralement 0,2-1,0 × 106 cellules) ont été remis en suspension dans 100 μl de PBS (sans Ca++ ni Mg++) additionné de 0,5 % d'albumine de sérum bovin, colorés avec des anticorps anti-humains spécifiques conjugués au fluorochrome ou des contrôles non spécifiques d'isotype correspondant et incubés au réfrigérateur 2 -8°C pendant 30 min. Après incubation, les cellules ont été lavées par centrifugation et remises en suspension dans 0,25-0,5 ml de PBS froid.

Les cellules testées ont été colorées avec des anticorps monoclonaux de souris pour CD45-FITC, CD45-PE un marqueur de leucocyte pan, marqueur de cellules T CD3-PE CD8-FITC, cellules T auxiliaires CD4-FITC, CD8-PE, marqueur de cellules tueuses naturelles (NK) CD56 -PE, le marqueur monocyte CD31-FITC et le marqueur des lymphocytes B CD19-PE.

La compensation des émissions a été effectuée par des tubes témoins positifs contenant des cellules qui ont été colorées avec CD45-FITC ou CD45-PE ; Les cellules mortes ont été exclues par coloration avec la 7-aminoactinomycine D, seules les cellules viables non colorées ont été analysées. Au moins 10 000 événements cellulaires par échantillon ont été analysés à l'aide du logiciel CellQuest Pro ou FlowJo. Des pourcentages de coloration d'anticorps de contrôle d'isotype, ne dépassant pas 1 % de cellules colorées, ont été utilisés pour définir les portes de coloration « positives » et ont été déduits des résultats d'anticorps spécifiques. Les résultats sont exprimés en pourcentage de cellules colorées.