Subpopulace imunitních buněk u pacientů s chřipkou A a B

Pozadí:

Koncem března a začátkem dubna 2009 bylo v Mexiku hlášeno propuknutí nového viru chřipky označeného jako chřipka A/H1N1 (populárně známá jako prasečí chřipka), přičemž následné případy byly pozorovány v mnoha zemích, což vedlo k prohlášení Světové zdravotnické organizace o celosvětovou pandemií.

První případ chřipky A/H1N1 v Izraeli byl diagnostikován na konci dubna 2009 v nemocnici Laniado u mladého muže vracejícího se z Mexika.

Chřipka A/H1N1 (prasečí chřipka) přináší relativně vysokou nemocnost, zejména u mladých pacientů. Včasná identifikace by umožnila rychlé zahájení terapie, čímž by se zlepšily výsledky.

V roce 2009, během pandemie H1N1 v Izraeli, proběhl výzkum na našem oddělení pediatrie. Výzkumníci Sharon et al. (1) porovnali skupinu 53 dětí infikovaných chřipkou A H1N1 se skupinou 53 dětí, které vykazovaly příznaky chřipky, ale byly shledány negativními na virus. Toto srovnání prokázalo významné snížení počtu lymfocytů během akutní fáze onemocnění (1.–3. den) s vymizením v den 7 (6–9) a rovněž snížení počtu neutrofilů v den 5 od nástupu vysoké horečky s následné rozlišení o 2-4 dny později (dny 7-10). Tento jev nebyl pozorován u pacientů, kteří nebyli infikováni virem H1N1. Podobné výsledky uvedli Cao a spoluautoři (2), kteří jej pozorovali u dětských i dospělých pacientů. Lewis et al naznačil, že lymfopenie je způsobena hlavně snížením počtu T buněk a v menší míře B buněk (3). Ukázalo se, že lymfopenie typická pro chřipku A H3N3 během akutního onemocnění je způsobena snížením počtu T i B buněk beze změny poměru CD4:CD8. To je v rozporu se zjištěními Cao et al. (2), kteří zaznamenali abnormální poměr CD4:CD8 u poloviny těch, kteří byli pozitivní na A H1N1. Jedním z možných vysvětlení, jak navrhuje Nichols and Collaborators (4), je, že časná lymfopenie a pozdější neutropenie u pacientů infikovaných chřipkou mohou představovat migraci těchto buněk z oběhu do infikovaného dýchacího traktu v důsledku infekce. Cíle našeho výzkumu Kvantifikovat B, T a NK populace lymfocytů během různých stádií onemocnění způsobeného chřipkou A H1N1.

Metody studie Subjekty studie byly děti hospitalizované na našem oddělení s příznaky a projevy chřipky. Rodiče nebo zákonní zástupci účastníků podepsali písemný souhlas. V první fázi byl odebrán výtěr z horních cest dýchacích ke stanovení přítomnosti chřipky A H1N1 (identifikace viru byla provedena pomocí RT - PCR). Poté byly kvantifikovány různé podtypy lymfocytů v různých stádiích onemocnění. Identifikace a kvantifikace různých typů buněk byla provedena metodou FACS, označené buněčné receptory byly CD31, CD19, CD4, CD3, CD45, CD8, CD56.

Laboratorní technika:

Buněčné markery byly hodnoceny průtokovou cytometrií. Barvení buněk bylo prováděno na jednobuněčných suspenzích za použití předem vychlazeného PBS v 5 ml FACS zkumavkách. Kroky promývání byly prováděny centrifugací po dobu 5 minut, 300 g, 5 °C, brzdění 5, po kterém byly supernatanty zcela odpipetovány a buněčné pelety (typicky obsahující 0,2-1,0 x 106 buňky) byly resuspendovány ve 100 μl PBS (bez Ca++ a Mg++) doplněném 0,5% hovězím sérovým albuminem, obarveny specifickými anti-lidskými protilátkami konjugovanými s fluorochromem nebo nespecifickými kontrolami se shodným izotypem a inkubovány v chladničce 2 -8°C po dobu 30 min. Po inkubaci byly buňky promyty centrifugací a resuspendovány v 0,25-0,5 ml studeného PBS.

Testované buňky byly obarveny myšími monoklonálními protilátkami na CD45-FITC, CD45-PE a pan leukocytový marker, T buněčný marker CD3-PE CD8-FITC, T pomocné buňky CD4-FITC, CD8-PE, přirozený zabíječský (NK) buněčný marker CD56 -PE, monocytový marker CD31-FITC a B buněčný marker CD19-PE.

Kompenzace emisí byla provedena pomocí pozitivních kontrolních zkumavek obsahujících buňky, které byly obarveny CD45-FITC nebo CD45-PE; Mrtvé buňky byly vyloučeny barvením 7-aminoaktinomycinem D, analyzovány byly pouze nebarvené životaschopné buňky. Pomocí softwaru CellQuest Pro nebo FlowJo bylo analyzováno alespoň 10 000 buněčných událostí na vzorek. Procenta barvení izotypové kontrolní protilátky, nepřesahující 1 % obarvených buněk, byla použita k nastavení 'pozitivních barvicích bran a byla odvozena z výsledků specifických protilátek. Výsledky jsou vyjádřeny jako procento obarvených buněk.