Subpopulações de células imunes em pacientes com influenza A e B

Fundo:

No final de março e início de abril de 2009, um surto de um novo vírus influenza designado influenza A/H1N1 (popularmente conhecido como gripe suína) foi relatado no México, com casos subseqüentes observados em muitos países, levando à declaração pela Organização Mundial da Saúde de uma pandemia mundial.

O primeiro caso de influenza A/H1N1 em Israel foi diagnosticado no final de abril de 2009 no Hospital Laniado em um jovem voltando do México.

Influenza A/H1N1 (gripe suína) carrega uma morbidade relativamente alta, particularmente em pacientes jovens. A identificação precoce permitiria o início imediato da terapia, melhorando assim os resultados.

Em 2009, durante a pandemia de H1N1 em Israel, foi realizada uma pesquisa em nosso departamento de pediatria. Os pesquisadores Sharon et al. (1) compararam um grupo de 53 crianças infectadas com Influenza A H1N1, com um grupo de 53 crianças que apresentaram sintomas de gripe, mas foram negativas para o vírus. Esta comparação demonstrou uma redução significativa na contagem de linfócitos durante a fase aguda da doença (dias 1-3) com resolução no dia 7 (6-9), bem como redução na contagem de neutrófilos no dia 5 desde o início da febre alta com resolução subsequente 2-4 dias depois (dias 7-10). Esse fenômeno não foi observado nos pacientes não infectados pelo vírus H1N1. Resultados semelhantes foram relatados por Cao e co-autores (2) que o observaram em pacientes pediátricos e adultos. Lewis et al sugeriram que a linfopenia se deve principalmente à redução das células T e, em menor grau, das células B (3). A linfopenia típica da influenza A H3N3 durante a doença aguda foi demonstrada devido a uma redução das células T e B sem alteração na relação CD4:CD8. Isso contrasta com os achados de Cao et al. (2) que observou uma relação CD4:CD8 anormal em metade daqueles que eram positivos para A H1N1. Uma das possíveis explicações propostas por Nichols e colaboradores (4) é que a linfopenia precoce e a posterior neutropenia nos pacientes infectados por influenza podem representar a migração dessas células da circulação para o trato respiratório infectado como consequência da infecção. Objetivos de nossa pesquisa Quantificar as populações de linfócitos B, T e NK durante as diferentes fases da doença causada pelo Infuenza A H1N1.

Métodos do estudo Os sujeitos do estudo foram crianças internadas em nosso serviço com sinais e sintomas de gripe. Os pais ou responsáveis ​​legais dos participantes assinaram um termo de consentimento por escrito. Na primeira etapa foi feito um swab respiratório superior para determinar a presença de Infuenza A H1N1 (a identificação do vírus foi feita por RT - PCR). Em seguida, os diferentes subtipos de linfócitos foram quantificados em diferentes estágios da doença. A identificação e quantificação dos diferentes tipos celulares foram realizadas pelo método FACS, os receptores celulares marcados foram CD31, CD19, CD4, CD3, CD45, CD8, CD56.

Técnica laboratorial:

Os marcadores celulares foram avaliados por citometria de fluxo. A coloração celular foi realizada em suspensões de células únicas usando PBS pré-resfriado em tubos FACS de 5 ml. As etapas de lavagem foram realizadas por centrifugação por 5 min, 300 g, 5°C, freio 5 após o qual os sobrenadantes foram completamente removidos com pipeta e os pellets de células (normalmente contendo 0,2-1,0 × 106 2 -8°C por 30 min. Após a incubação, as células foram lavadas por centrifugação e ressuspensas em 0,25-0,5 ml de PBS frio.

As células testadas foram coradas com anticorpos monoclonais de camundongo para CD45-FITC, CD45-PE um marcador de leucócitos pan, marcador de células T CD3-PE CD8-FITC, células T auxiliares CD4-FITC, CD8-PE, marcador de células natural killer (NK) CD56 -PE, marcador de monócitos CD31-FITC e marcador de células B CD19-PE.

A compensação de emissão foi feita por tubos de controle positivo contendo células que foram coradas com CD45-FITC ou CD45-PE; As células mortas foram excluídas por coloração com 7-aminoactinomicina D, apenas as células viáveis ​​não coradas foram analisadas. Pelo menos 10.000 eventos celulares por amostra foram analisados ​​usando o software CellQuest Pro ou FlowJo. As porcentagens de coloração de anticorpo de controle de isotipo, não excedendo 1% de células coradas, foram usadas para definir os limites de coloração "positivos" e foram deduzidas dos resultados de anticorpos específicos. Os resultados são expressos como a porcentagem de células coradas.