Subpopulationer av immunceller i influensa A- och B-patienter

Bakgrund:

I slutet av mars och början av april 2009 rapporterades ett utbrott av ett nytt influensavirus betecknat A/H1N1-influensa (i folkmun känd som svininfluensa) i Mexiko, med efterföljande fall observerade i många länder, vilket ledde till att Världshälsoorganisationen förklarade en världsomspännande pandemi.

Det första fallet av influensa A/H1N1 i Israel diagnostiserades i slutet av april 2009 på Laniado Hospital hos en ung man som återvände från Mexiko.

Influensa A/H1N1 (svininfluensa) har en relativt hög sjuklighet, särskilt hos unga patienter. Tidig identifiering skulle möjliggöra omedelbar initiering av terapi, och därigenom förbättra resultaten.

Under 2009, under H1N1-pandemin i Israel, genomfördes en forskning på vår avdelning för pediatrik. Forskarna Sharon et al. (1) har jämfört en grupp på 53 barn infekterade med influensa A H1N1, med en grupp på 53 barn som uppvisade influensasymptom men visade sig vara negativa för viruset. Denna jämförelse visade en signifikant minskning av antalet lymfocyter under den akuta fasen av sjukdomen (dag 1-3) med upplösning på dag 7 (6-9) samt minskning av antalet neutrofiler på dag 5 från början av hög feber med efterföljande upplösning 2-4 dagar senare (dagar 7-10). Detta fenomen observerades inte hos patienter som inte var infekterade med H1N1-viruset. Liknande resultat rapporterades av Cao och medförfattare (2) som observerade det hos både pediatriska och vuxna patienter. Lewis med flera föreslog att lymfopenin främst beror på minskning av T-celler och i mindre utsträckning i B-celler (3). Den lymfopeni som är typisk för influensa A H3N3 under akut sjukdom visade sig bero på en minskning av både T- och B-celler utan förändring i förhållandet CD4:CD8. Detta står i motsats till resultaten av Cao et al. (2) som noterade ett onormalt förhållande mellan CD4:CD8 hos hälften av dem som var positiva för A H1N1. En av de möjliga förklaringarna som föreslagits av Nichols and Collaborators (4) är att tidig lymfopeni och senare neutropeni hos influensainfekterade patienter kan representera migration av dessa celler från cirkulationen till de infekterade luftvägarna som en konsekvens av infektion. Mål för vår forskning Att kvantifiera B-, T- och NK-populationerna av lymfocyter under olika stadier av sjukdomen orsakad av Infuenza A H1N1.

Studiemetoder Försökspersonerna i studien var barn som var inlagda på vår avdelning med tecken och symtom på influensa. Deltagarnas föräldrar eller vårdnadshavare har undertecknat ett skriftligt samtycke. I det första steget togs en övre andningsprov för att fastställa närvaron av Infuenza A H1N1 (virusidentifieringen gjordes med RT - PCR). Sedan kvantifierades de olika subtyperna av lymfocyter vid olika stadier av sjukdomen. Identifieringen och kvantifieringen av de olika celltyperna utfördes med FACS-metoden, cellreceptorerna som markerades var CD31, CD19, CD4, CD3, CD45, CD8, CD56.

Laboratorieteknik:

Cellulära markörer bedömdes med flödescytometri. Cellfärgning utfördes på encellsuspensioner med användning av förkyld PBS i 5 ml FACS-rör. Tvättstegen utfördes genom centrifugering i 5 minuter, 300 g, 5°C, broms 5, varefter supernatanterna pipetterades fullständigt av och cellpellets (vanligtvis innehållande 0,2-1,0×106 celler) återsuspenderades i 100 μl PBS (utan Ca++ och Mg++) kompletterat med 0,5 % bovint serumalbumin, färgades med specifika fluorokromkonjugerade anti-humana antikroppar eller isotypmatchade ospecifika kontroller och inkuberades i kylskåp 2 -8°C i 30 min. Efter inkubation tvättades cellerna genom centrifugering och återsuspenderades i 0,25-0,5 ml kall PBS.

Testade celler färgades med mus monoklonala antikroppar för CD45-FITC, CD45-PE en panleukocytmarkör, T-cellsmarkör CD3-PE CD8-FITC, T-hjälparceller CD4-FITC, CD8-PE, Natural Killer (NK) cellmarkör CD56 -PE, monocytmarkör CD31-FITC och B-cellsmarkör CD19-PE.

Emissionskompensation gjordes av positiva kontrollrör innehållande celler som färgades med CD45-FITC eller CD45-PE; Döda celler exkluderades genom färgning med 7-aminoaktinomycin D, endast ofärgade livskraftiga celler analyserades. Minst 10 000 cellulära händelser per prov analyserades med hjälp av programvaran CellQuest Pro eller FlowJo. Procentandelar av isotypkontrollantikroppsfärgning, som inte översteg 1 % färgade celler, användes för att ställa in "positiva" färgningsgrindar och härleddes från de specifika antikroppsresultaten. Resultaten uttrycks som procentandelen färgade celler.