Sottopopolazioni di cellule immunitarie nei pazienti con influenza A e B

Sfondo:

Alla fine di marzo e all'inizio di aprile 2009 è stato segnalato in Messico un focolaio di un nuovo virus influenzale denominato influenza A/H1N1 (popolarmente noto come influenza suina), con successivi casi osservati in molti paesi, che ha portato alla dichiarazione da parte dell'Organizzazione mondiale della sanità di un pandemia mondiale.

Il primo caso di influenza A/H1N1 in Israele è stato diagnosticato alla fine di aprile 2009 all'ospedale di Laniado in un giovane di ritorno dal Messico.

L'influenza A/H1N1 (influenza suina) comporta una morbilità relativamente elevata, in particolare nei pazienti giovani. L'identificazione precoce consentirebbe un tempestivo inizio della terapia, migliorando così i risultati.

Nel 2009, durante la pandemia di H1N1 in Israele, è stata condotta una ricerca nel nostro dipartimento di pediatria. I ricercatori Sharon et al. (1) hanno confrontato un gruppo di 53 bambini infetti da Influenza A H1N1, con un gruppo di 53 bambini che presentavano sintomi influenzali ma erano risultati negativi al virus. Questo confronto ha dimostrato una significativa riduzione della conta dei linfociti durante la fase acuta della malattia (giorni 1-3) con risoluzione al giorno 7 (6-9) e una riduzione della conta dei neutrofili al giorno 5 dall'inizio della febbre alta con successiva risoluzione 2-4 giorni dopo (giorni 7-10). Questo fenomeno non è stato osservato nei pazienti che non erano stati infettati dal virus H1N1. Risultati simili sono stati riportati da Cao e coautori (2) che lo hanno osservato sia in pazienti pediatrici che adulti. Lewis et al. hanno suggerito che la linfopenia sia principalmente dovuta alla riduzione dei linfociti T e, in misura minore, dei linfociti B (3). È stato dimostrato che la linfopenia tipica dell'influenza A H3N3 durante la malattia acuta è dovuta a una riduzione di entrambi i linfociti T e B senza alterazione del rapporto CD4:CD8. Ciò è in contrasto con i risultati di Cao et al. (2) che hanno notato un rapporto CD4:CD8 anormale nella metà di coloro che erano positivi per A H1N1. Una delle possibili spiegazioni proposte da Nichols e Collaboratori (4) è che la linfopenia precoce e la successiva neutropenia nei pazienti con infezione influenzale possano rappresentare la migrazione di queste cellule dalla circolazione al tratto respiratorio infetto come conseguenza dell'infezione. Obiettivi della nostra ricerca Quantificare le popolazioni di linfociti B, T e NK durante i diversi stadi della malattia causata da Infuenza A H1N1.

Metodi di studio I soggetti dello studio sono bambini ricoverati presso il nostro reparto con segni e sintomi influenzali. I genitori o tutori legali dei partecipanti hanno firmato un consenso scritto. Nella prima fase è stato prelevato un tampone delle vie respiratorie superiori per determinare la presenza di Infuenza A H1N1 (l'identificazione del virus è stata effettuata mediante RT - PCR). Quindi i diversi sottotipi di linfociti sono stati quantificati nelle diverse fasi della malattia. L'identificazione e la quantificazione dei diversi tipi di cellule sono state eseguite con il metodo FACS, i recettori cellulari contrassegnati erano CD31, CD19, CD4, CD3, CD45, CD8, CD56.

Tecnica di laboratorio:

I marcatori cellulari sono stati valutati mediante citometria a flusso. La colorazione cellulare è stata eseguita su sospensioni unicellulari utilizzando PBS pre-raffreddato in provette FACS da 5 ml. Le fasi di lavaggio sono state eseguite mediante centrifugazione per 5 minuti, 300 g, 5°C, freno 5, dopodiché i surnatanti sono stati completamente pipettati e i pellet cellulari (tipicamente contenenti 0,2-1,0 × 106 cellule) sono state risospese in 100 μl di PBS (senza Ca++ e Mg++) addizionate con albumina di siero bovino allo 0,5%, colorate con specifici anticorpi anti-umani coniugati con fluorocromo o controlli non specifici con corrispondenza isotipica e incubate in frigorifero 2 -8°C per 30 min. Dopo l'incubazione, le cellule sono state lavate mediante centrifugazione e risospese in 0,25-0,5 ml di PBS freddo.

Le cellule testate sono state colorate con anticorpi monoclonali di topo per CD45-FITC, CD45-PE un marcatore di leucociti pan, marcatore di cellule T CD3-PE CD8-FITC, cellule T helper CD4-FITC, CD8-PE, marcatore di cellule natural killer (NK) CD56 -PE, marcatore di monociti CD31-FITC e marcatore di cellule B CD19-PE.

La compensazione delle emissioni è stata eseguita da provette di controllo positivo contenenti cellule colorate con CD45-FITC o CD45-PE; Le cellule morte sono state escluse mediante colorazione con 7-amminoattinomicina D, sono state analizzate solo cellule vitali non colorate. Almeno 10.000 eventi cellulari per campione sono stati analizzati utilizzando il software CellQuest Pro o FlowJo. Le percentuali di colorazione dell'anticorpo di controllo dell'isotipo, non superiori all'1% di cellule colorate, sono state utilizzate per impostare i gate di colorazione "positivi" e sono state dedotte dai risultati degli anticorpi specifici. I risultati sono espressi come percentuale di cellule colorate.