Underpopulasjoner av immunceller i influensa A- og B-pasienter

Bakgrunn:

I slutten av mars og begynnelsen av april 2009 ble det rapportert om et utbrudd av et nytt influensavirus kalt A/H1N1-influensa (populært kjent som svineinfluensa) i Mexico, med påfølgende tilfeller observert i mange land, noe som førte til erklæringen fra Verdens helseorganisasjon om en verdensomspennende pandemi.

Det første tilfellet av influensa A/H1N1 i Israel ble diagnostisert i slutten av april 2009 ved Laniado Hospital hos en ung mann som kom tilbake fra Mexico.

Influensa A/H1N1 (svineinfluensa) har en relativt høy sykelighet, spesielt hos unge pasienter. Tidlig identifikasjon vil muliggjøre rask oppstart av terapi, og dermed forbedre resultatene.

I 2009, under H1N1-pandemien i Israel, ble det utført en forskning i vår barneavdeling. Forskerne Sharon et al. (1) har sammenlignet en gruppe på 53 barn infisert med influensa A H1N1, med en gruppe på 53 barn som hadde influensasymptomer, men som ble funnet negative for viruset. Denne sammenligningen viste en signifikant reduksjon i antall lymfocytter under den akutte fasen av sykdommen (dag 1-3) med oppløsning på dag 7 (6-9) samt reduksjon i antall nøytrofile på dag 5 fra begynnelsen av høy feber med påfølgende oppløsning 2-4 dager senere (dager 7-10). Dette fenomenet ble ikke observert hos pasienter som ikke var infisert med H1N1-viruset. Lignende resultater ble rapportert av Cao og medforfattere (2) som observerte det hos både pediatriske og voksne pasienter. Lewis et al antydet at lymfopenien hovedsakelig skyldes reduksjon i T-celler og i mindre grad i B-celler (3). Den typiske lymfopenien for influensa A H3N3 under akutt sykdom ble vist å skyldes en reduksjon i både T- og B-celler uten endring i CD4:CD8-forholdet. Dette er i motsetning til funnene til Cao et al. (2) som bemerket et unormalt CD4:CD8-forhold hos halvparten av de som var positive for A H1N1. En av de mulige forklaringene som foreslått av Nichols og samarbeidspartnere (4) er at tidlig lymfopeni og senere nøytropeni hos influensainfiserte pasienter kan representere migrasjon av disse cellene fra sirkulasjonen til de infiserte luftveiene som følge av infeksjon. Mål med vår forskning Å kvantifisere B-, T- og NK-populasjonene av lymfocytter under ulike stadier av sykdommen forårsaket av Infuenza A H1N1.

Studiemetoder Undersøkelsens emner var barn som var innlagt ved vår avdeling med tegn og symptomer på influensa. Foreldrene eller foresatte til deltakerne har signert et skriftlig samtykke. På det første stadiet ble en øvre luftveisprøve tatt for å bestemme tilstedeværelsen av Infuenza A H1N1 (virusidentifikasjonen ble gjort ved RT - PCR). Deretter ble de forskjellige undertypene av lymfocytter kvantifisert ved forskjellige stadier av sykdommen. Identifikasjonen og kvantifiseringen av de forskjellige celletypene ble utført ved FACS-metoden, cellereseptorene som ble merket var CD31, CD19, CD4, CD3, CD45, CD8, CD56.

Laboratorieteknikk:

Cellulære markører ble vurdert ved flowcytometri. Cellefarging ble utført på enkeltcellesuspensjoner ved bruk av forhåndskjølt PBS i 5 ml FACS-rør. Vasketrinn ble utført ved sentrifugering i 5 minutter, 300 g, 5°C, brems 5, hvoretter supernatantene ble fullstendig pipettert og cellepelleter (vanligvis inneholdende 0,2-1,0×106 celler) ble resuspendert i 100 μl PBS (uten Ca++ og Mg++) supplert med 0,5 % bovint serumalbumin, farget med spesifikke fluorokrom-konjugerte anti-humane antistoffer eller isotype-matchede ikke-spesifikke kontroller og inkubert i kjøleskap 2 -8°C i 30 min. Etter inkubering ble cellene vasket ved sentrifugering og resuspendert i 0,25-0,5 ml kald PBS.

Celler som ble testet ble farget med musemonoklonale antistoffer for CD45-FITC, CD45-PE en panleukocyttmarkør, T-cellemarkør CD3-PE CD8-FITC, T-hjelpeceller CD4-FITC, CD8-PE, Natural Killer (NK) cellemarkør CD56 -PE, monocyttmarkør CD31-FITC og B-cellemarkør CD19-PE.

Emisjonskompensasjon ble utført av positive kontrollrør som inneholdt celler som var farget med CD45-FITC eller CD45-PE; Døde celler ble ekskludert ved farging med 7-aminoaktinomycin D, kun ufargede levedyktige celler ble analysert. Minst 10 000 cellulære hendelser per prøve ble analysert ved bruk av CellQuest Pro eller FlowJo-programvaren. Prosentandeler av isotypekontrollantistofffarging, som ikke overstiger 1 % fargede celler, ble brukt til å sette de "positive" fargingsportene, og ble utledet fra de spesifikke antistoffresultatene. Resultatene er uttrykt som prosentandelen av fargede celler.