Субпопуляции иммунных клеток у пациентов с гриппом А и В

Задний план:

В конце марта и начале апреля 2009 г. в Мексике была зарегистрирована вспышка нового вируса гриппа, обозначенного как грипп A/H1N1 (широко известный как свиной грипп), с последующими случаями, наблюдавшимися во многих странах, что привело к объявлению Всемирной организацией здравоохранения всемирная пандемия.

Первый случай гриппа A/H1N1 в Израиле был диагностирован в конце апреля 2009 года в больнице Ланиадо у молодого человека, вернувшегося из Мексики.

Грипп A/H1N1 (свиной грипп) вызывает относительно высокую заболеваемость, особенно среди молодых пациентов. Раннее выявление позволит быстро начать терапию, тем самым улучшая результаты.

В 2009 году во время пандемии гриппа H1N1 в Израиле в нашем отделении педиатрии было проведено исследование. Исследователи Шарон и соавт. (1) сравнили группу из 53 детей, инфицированных гриппом A H1N1, с группой из 53 детей, у которых были симптомы гриппа, но вирус был отрицательным. Это сравнение продемонстрировало значительное снижение количества лимфоцитов в острой фазе заболевания (1-3-й день) с разрешением на 7-й (6-9-й) день, а также снижение количества нейтрофилов на 5-й день от начала высокой лихорадки с последующее разрешение через 2-4 дня (дни 7-10). Это явление не наблюдалось у пациентов, не инфицированных вирусом H1N1. Аналогичные результаты были получены Цао и соавторами (2), которые наблюдали его как у детей, так и у взрослых пациентов. Lewis и соавторы предположили, что лимфопения в основном связана с уменьшением Т-клеток и в меньшей степени В-клеток (3). Было показано, что лимфопения, типичная для гриппа A H3N3 во время острого заболевания, связана со снижением как Т-, так и В-клеток без изменения соотношения CD4:CD8. Это противоречит выводам Cao et al. (2) которые отметили аномальное соотношение CD4:CD8 у половины тех, кто был положительным на A H1N1. Одно из возможных объяснений, предложенное Nichols и Collaborators (4), состоит в том, что ранняя лимфопения и более поздняя нейтропения у пациентов, инфицированных гриппом, могут представлять собой миграцию этих клеток из кровотока в инфицированные дыхательные пути в результате инфекции. Цели нашего исследования. Количественная оценка популяций В, Т и NK лимфоцитов на разных стадиях заболевания, вызванного гриппом А H1N1.

Методы исследования. Объектами исследования были дети, госпитализированные в наше отделение с признаками и симптомами гриппа. Родители или законные опекуны участников подписали письменное согласие. На первом этапе брали мазок из верхних дыхательных путей на наличие вируса гриппа А H1N1 (идентификация вируса проводилась методом ОТ - ПЦР). Затем проводили количественную оценку различных подтипов лимфоцитов на разных стадиях заболевания. Идентификацию и количественную оценку различных типов клеток проводили методом FACS, клеточные рецепторы, которые были помечены, представляли собой CD31, CD19, CD4, CD3, CD45, CD8, CD56.

Лабораторная техника:

Клеточные маркеры оценивали с помощью проточной цитометрии. Окрашивание клеток проводили на суспензиях отдельных клеток с использованием предварительно охлажденного PBS в 5 мл пробирках FACS. Стадии промывки выполняли центрифугированием в течение 5 мин, 300 g, 5°C, паузой 5, после чего супернатанты полностью удаляли пипеткой и осадок клеток (обычно содержащий 0,2-1,0×106 клеток) ресуспендировали в 100 мкл PBS (без Ca++ и Mg++), дополненного 0,5% бычьим сывороточным альбумином, окрашивали специфическими античеловеческими антителами, конъюгированными с флуорохромом, или неспецифическими контролями, соответствующими изотипу, и инкубировали в холодильнике 2 -8°С в течение 30 мин. После инкубации клетки промывали центрифугированием и ресуспендировали в 0,25-0,5 мл холодного PBS.

Исследуемые клетки окрашивали мышиными моноклональными антителами к CD45-FITC, CD45-PE, панлейкоцитарному маркеру, Т-клеточному маркеру CD3-PE, CD8-FITC, Т-хелперным клеткам CD4-FITC, CD8-PE, маркеру естественных киллеров (NK) CD56. -PE, маркер моноцитов CD31-FITC и маркер В-клеток CD19-PE.

Компенсацию эмиссии проводили с помощью пробирок положительного контроля, содержащих клетки, окрашенные CD45-FITC или CD45-PE; Мертвые клетки исключали окрашиванием 7-аминоактиномицином D, анализировали только неокрашенные жизнеспособные клетки. Не менее 10 000 клеточных событий на образец анализировали с использованием программного обеспечения CellQuest Pro или FlowJo. Процент окрашивания контрольного изотипического антитела, не превышающий 1% окрашенных клеток, использовали для установки «положительных» ворот окрашивания и выводили из результатов для специфического антитела. Результаты выражают в процентах окрашенных клеток.