Subpopulacje komórek odpornościowych u pacjentów z grypą A i B

Tło:

Pod koniec marca i na początku kwietnia 2009 r. w Meksyku odnotowano ognisko nowego wirusa grypy określanego jako grypa A/H1N1 (popularnie znanego jako świńska grypa), a kolejne przypadki zaobserwowano w wielu krajach, co doprowadziło do ogłoszenia przez Światową Organizację Zdrowia światowa pandemia.

Pierwszy przypadek grypy A/H1N1 w Izraelu wykryto pod koniec kwietnia 2009 roku w szpitalu Laniado u młodego mężczyzny wracającego z Meksyku.

Grypa A/H1N1 (świńska grypa) niesie ze sobą stosunkowo wysoką zachorowalność, szczególnie wśród młodych pacjentów. Wczesna identyfikacja umożliwiłaby szybkie rozpoczęcie terapii, a tym samym poprawę wyników.

W 2009 roku, podczas pandemii grypy H1N1 w Izraelu, przeprowadzono badania na naszym oddziale pediatrii. Badacze Sharon i in. (1) porównali grupę 53 dzieci zakażonych wirusem grypy typu A H1N1 z grupą 53 dzieci, u których wykazano objawy grypy, ale u których stwierdzono obecność wirusa. To porównanie wykazało istotne zmniejszenie liczby limfocytów w ostrej fazie choroby (dni 1-3) z ustąpieniem w dniu 7 (6-9), jak również zmniejszenie liczby neutrofili w dniu 5 od początku wysokiej gorączki z kolejne rozwiązanie 2-4 dni później (dni 7-10). Zjawiska tego nie obserwowano u pacjentów niezakażonych wirusem H1N1. Podobne wyniki uzyskali Cao i współautorzy (2), którzy zaobserwowali to zarówno u pacjentów pediatrycznych, jak i dorosłych. Lewis i wsp. zasugerowali, że limfopenia jest spowodowana głównie zmniejszeniem liczby limfocytów T iw mniejszym stopniu limfocytów B (3). Wykazano, że limfopenia typowa dla grypy A H3N3 podczas ostrej choroby jest spowodowana zmniejszeniem liczby komórek T i B bez zmiany stosunku CD4: CD8. Jest to sprzeczne z ustaleniami Cao i in. (2), którzy zauważyli nieprawidłowy stosunek CD4:CD8 u połowy osób, które były pozytywne w kierunku A H1N1. Jednym z możliwych wyjaśnień zaproponowanych przez Nicholsa i współpracowników (4) jest to, że wczesna limfopenia i późniejsza neutropenia u pacjentów zakażonych grypą mogą odzwierciedlać migrację tych komórek z krążenia do zakażonych dróg oddechowych w wyniku zakażenia. Cele naszych badań Określenie ilościowe populacji limfocytów B, T i NK w różnych stadiach choroby wywołanej przez grypę A H1N1.

Metody badań Badanymi były dzieci hospitalizowane na naszym oddziale z objawami grypy. Rodzice lub opiekunowie prawni uczestników podpisali pisemną zgodę. W pierwszym etapie pobrano wymaz z górnych dróg oddechowych na obecność grypy A H1N1 (identyfikację wirusa wykonano metodą RT - PCR). Następnie określono ilościowo różne podtypy limfocytów w różnych stadiach choroby. Identyfikację i oznaczenie ilościowe różnych typów komórek przeprowadzono metodą FACS, znakowanymi receptorami komórkowymi były CD31, CD19, CD4, CD3, CD45, CD8, CD56.

Technika laboratoryjna:

Markery komórkowe oceniano za pomocą cytometrii przepływowej. Barwienie komórek przeprowadzono na zawiesinach pojedynczych komórek, stosując wstępnie schłodzony PBS w 5 ml probówkach FACS. Etapy przemywania przeprowadzono przez wirowanie przez 5 min, 300 g, 5°C, przerwa 5, po czym całkowicie odpipetowano supernatanty i osady komórek (zwykle zawierające 0,2-1,0 x 106 komórki) ponownie zawieszono w 100 μl PBS (bez Ca++ i Mg++) uzupełnionego 0,5% albuminą surowicy bydlęcej, wybarwiono swoistymi przeciwciałami anty-ludzkimi skoniugowanymi z fluorochromem lub nieswoistymi kontrolami o dopasowanym izotypie i inkubowano w lodówce 2 -8°C przez 30 min. Po inkubacji komórki przemyto przez odwirowanie i ponownie zawieszono w 0,25-0,5 ml zimnego PBS.

Testowane komórki barwiono mysimi przeciwciałami monoklonalnymi dla CD45-FITC, CD45-PE a markera leukocytów, markera limfocytów T CD3-PE, CD8-FITC, komórek pomocniczych T CD4-FITC, CD8-PE, markera komórek naturalnych zabójców (NK) CD56 -PE, marker monocytów CD31-FITC i marker komórek B CD19-PE.

Kompensację emisji przeprowadzono za pomocą probówek z kontrolą pozytywną zawierających komórki wybarwione CD45-FITC lub CD45-PE; Martwe komórki wykluczono przez barwienie 7-aminoaktynomycyną D, analizowano tylko niezabarwione żywe komórki. Za pomocą oprogramowania CellQuest Pro lub FlowJo przeanalizowano co najmniej 10 000 zdarzeń komórkowych na próbkę. Procenty barwienia izotypowego przeciwciała kontrolnego, nieprzekraczające 1% wybarwionych komórek, stosowano do ustawienia „pozytywnych” bramek barwienia i wywnioskowano z wyników swoistych przeciwciał. Wyniki wyrażono jako procent wybarwionych komórek.