正畸治疗期间唾液的微生物组和免疫原性

来自维也纳大学牙科诊所正畸临床分部的成年患者（18 岁及以上）将在同意后根据规定的纳入/排除标准被邀请参加这项微生物学试点研究。 这项研究是一个试点项目，因此不会进行样本量计算。 20 名患者将接受 Invisalign® 矫治器治疗，20 名患者将接受多托槽治疗。 之前的一项微生物学研究表明，舌侧正畸治疗对口腔微生物群有短期影响。 另一项关于牙种植体定植的微生物研究也报告了种植治疗后的细菌转移。

在收集临床记录的当天，所有患者都将获得口腔卫生方面的指导。 在向患者提供治疗计划的那一天，牙菌斑指数将由训练有素的正畸医生进行评估。 治疗开始时，需要 < 20% 的斑块指数。 在正畸治疗开始前一天，将进行T0样本采集并评估牙周指标。 包括牙周探诊深度、探诊出血和牙菌斑指数 (PI) 在内的临床检查将在矫治器或托槽治疗开始前 (T0)、3 个月后 (T1) 和 6 个月后进行。 根据我们的方案，将通过刺激唾液收集进行微生物采样。 唾液样本将分成等份，储存在 -80°C 的冷冻管中。 通过 16S rDNA 基因测序对微生物进行分子检测、测序分析和分类学分配将在维也纳医科大学检验医学系进行。

通过对 16s rDNA 基因进行测序和唾液中细菌的测序分析和分类学分配，我们希望揭示不同时间点之间微生物门/属的可能变化。 宏基因组研究通常通过分析原核 16S 核糖体 RNA 基因 (16S rRNA) 来进行，该基因长约 1,500 个碱基对，包含散布在保守区域之间的九个可变区域。 16S rRNA 的可变区经常用于系统发育分类，例如不同微生物种群中的属或种。

DNA提取：

由于与商业 DNA 提取试剂盒相比具有更好的定量和定性结果，因此将使用改进的基于 CTAB SDS 氯仿的方法分离 DNA。 在添加蛋白酶 K（Qiagen，Venlo，Netherlands）以及洗涤剂 SDS（十二烷基硫酸钠）和 CTAB（十六烷基三甲基溴化铵）的情况下，将使用 1mm 的二氧化硅球体进行机械分析。 提取后，将使用 Qubit® 2.0 通过 dsDNA HS 试剂盒（Life Technologies，Carlsbad，California）和 NanoDrop 2000c 分光光度计（Thermo Scientific，Waltham，Massachusetts）测定 DNA 数量。 此外，吸收比率 A260/280 和 A260/230 将用于估计 DNA 的纯度。

宏基因组分析：

样品中细菌有机体的总体组成将通过分析微生物组来评估。 因此，我们将使用 MiSeq® 平台（Illumina，圣地亚哥，加利福尼亚）进行高通量测序。 我们将分析 16S rRNA 基因的可变 V3 和 V4 区域。 对于系统发育分类，将使用引物 27F（5'-CCT ACG GGN GGC WGC AG-3'）和 1391R（5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3'）扩增细菌 16S rRNA。

生物信息学分析：

下一代测序运行的质量将使用软件 FASTQC 0.11.4 进行评估。 低质量碱基的去除将使用 Trimmomatic-0.35 软件进行。 对于序列分析和将相似序列聚类成簇 (OTU)，将使用 UPARSE 管道。 为了对微生物组数据进行比较和统计分析，我们将使用 RStudio（Team 2016）作为平台，以 R 为语言（R Development Core Team 2010）和不同的 R 包。