Microbiome et immunogénicité de la salive pendant la thérapie orthodontique

Les patients adultes (18 ans et plus) de la division clinique d'orthodontie de la clinique universitaire de médecine dentaire de Vienne seront invités à participer à cette étude microbiologique pilote selon des critères d'inclusion/exclusion définis après avoir donné leur consentement. Cette étude est un projet pilote et, par conséquent, aucun calcul de taille d'échantillon ne sera effectué. Vingt patients seront traités avec des aligneurs Invisalign® et vingt patients recevront une thérapie multibrackets. Une précédente étude microbiologique a montré que la thérapie orthodontique linguale a un effet à court terme sur la microflore buccale. Une autre étude microbienne sur la colonisation des implants dentaires a également rapporté un déplacement bactérien lors de la thérapie implantaire.

Tous les patients recevront des instructions d'hygiène bucco-dentaire le jour de la collecte des dossiers cliniques. Le jour où le plan de traitement sera présenté au patient, l'indice de plaque sera évalué par un orthodontiste qualifié. Pour le début du traitement, un indice de plaque < 20 % est requis. La veille du début du traitement orthodontique, un prélèvement d'échantillon T0 sera effectué et les indices parodontaux seront évalués. Un examen clinique comprenant la profondeur de sondage parodontal, le saignement au sondage et l'indice de plaque (IP) sera effectué avant (T0), après 3 mois (T1) et après 6 mois après le début du traitement par aligneurs ou brackets. Le prélèvement microbiologique sera réalisé par prélèvement salivaire stimulé selon notre protocole. Les échantillons de salive seront divisés en aliquotes et conservés dans des cryo-tubes à -80°C. La détection moléculaire de micro-organismes par séquençage des gènes d'ADNr 16S, l'analyse de séquençage et l'attribution taxonomique seront effectuées au Département de médecine de laboratoire de l'Université de médecine de Vienne.

En séquençant des gènes d'ADNr 16s avec une analyse de séquençage et une attribution taxonomique de bactéries dans la salive, nous espérons révéler des changements possibles dans les phylums/genres microbiens entre différents moments. Les études métagénomiques sont généralement réalisées en analysant le gène de l'ARN ribosomique procaryote 16S (ARNr 16S), qui mesure environ 1 500 paires de bases et contient neuf régions variables intercalées entre des régions conservées. Les régions variables de l'ARNr 16S sont fréquemment utilisées dans les classifications phylogénétiques telles que le genre ou l'espèce dans diverses populations microbiennes.

Extraction d'ADN :

En raison de meilleurs résultats quantitatifs et qualitatifs par rapport aux kits d'extraction d'ADN commerciaux, l'ADN sera isolé avec une méthode modifiée à base de chloroforme CTAB SDS. L'analyse mécanique sera effectuée à l'aide de sphères de silice de 1 mm additionnées de protéinase K (Qiagen, Venlo, Pays-Bas) ainsi que des détergents SDS (dodécylsulfate de sodium) et CTAB (bromure de cétyltriméthylammonium). Après extraction, la quantité d'ADN sera déterminée avec Qubit® 2.0 via le kit dsDNA HS (Life Technologies, Carlsbad, Californie) et le spectrophotomètre NanoDrop 2000c (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts). De plus, les taux d'absorption A260/280 et A260/230 seront utilisés pour estimer la pureté de l'ADN.

Analyse du métagénome :

La composition globale des organismes bactériens dans les échantillons sera évaluée en analysant le microbiome. Par conséquent, nous utiliserons le séquençage à haut débit avec la plateforme MiSeq® (Illumina, San Diego, Californie). Nous analyserons les régions variables V3 et V4 du gène de l'ARNr 16S. Pour la classification phylogénétique, l'ARNr 16S bactérien sera amplifié à l'aide des amorces 27F (5'-CCT ACG GGN GGC WGC AG-3') et 1391R (5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3').

Analyse bioinformatique :

La qualité du cycle de séquençage de nouvelle génération sera évaluée à l'aide du logiciel FASTQC 0.11.4. La suppression des bases de mauvaise qualité sera réalisée avec le logiciel Trimmomatic-0.35. Pour l'analyse de séquences et le regroupement de séquences similaires en clusters (OTU), le pipeline UPARSE sera utilisé. Pour la comparaison et l'analyse statistique des données sur le microbiome, nous utiliserons RStudio (Team 2016) comme plate-forme avec R comme langage (R Development Core Team 2010) et différents R-packages.