Microbioma e Imunogenidade da Saliva Durante a Terapia Ortodôntica

Pacientes adultos (18 anos ou mais) da Divisão Clínica de Ortodontia da Clínica Universitária de Odontologia de Viena serão convidados a participar deste estudo microbiológico piloto de acordo com os critérios de inclusão/exclusão definidos após o consentimento. Este estudo é um projeto piloto e, portanto, nenhum cálculo de tamanho de amostra será feito. Vinte pacientes serão tratados com alinhadores Invisalign® e vinte pacientes receberão terapia multibracket. Um estudo microbiológico anterior mostrou que a terapia ortodôntica lingual tem um efeito de curto prazo na microflora oral. Outro estudo microbiano sobre a colonização em implantes dentários também relatou mudança bacteriana após a terapia com implantes.

Todos os pacientes receberão orientações sobre higiene bucal no dia da coleta do prontuário. No dia em que o plano de tratamento será apresentado ao paciente, o Índice de Placa será avaliado por um ortodontista treinado. Para o início do tratamento é necessário um índice de placa < 20%. No dia anterior ao início do tratamento ortodôntico, será realizada a coleta de amostras T0 e os índices periodontais serão avaliados. Um exame clínico incluindo profundidade de sondagem periodontal, sangramento à sondagem e índice de placa (PI) será realizado antes (T0), após 3 meses (T1) e após 6 meses do início da terapia com alinhadores ou bráquetes. A amostragem microbiológica será realizada por coleta de saliva estimulada de acordo com nosso protocolo. As amostras de saliva serão divididas em alíquotas e armazenadas em criotubos a -80°C. A detecção molecular de microrganismos por sequenciamento de genes 16S rDNA, análise de sequenciamento e atribuição taxonômica será realizada no Departamento de Medicina Laboratorial da Universidade Médica de Viena.

Ao sequenciar os genes 16s rDNA com análise de sequenciamento e atribuição taxonômica de bactérias na saliva, esperamos revelar possíveis mudanças nos filos/gêneros microbianos entre vários pontos no tempo. Estudos metagenômicos são comumente realizados por meio da análise do gene procariótico 16S ribossomal RNA (16S rRNA), que tem aproximadamente 1.500 pares de bases e contém nove regiões variáveis ​​intercaladas entre regiões conservadas. Regiões variáveis ​​de 16S rRNA são freqüentemente usadas em classificações filogenéticas como gênero ou espécie em diversas populações microbianas.

Extração de DNA:

Devido aos melhores resultados quantitativos e qualitativos em comparação com kits comerciais de extração de DNA, o DNA será isolado com um método modificado CTAB SDS baseado em clorofórmio. A análise mecânica será realizada utilizando esferas de sílica de 1mm sob adição de proteinase K (Qiagen, Venlo, Holanda) e dos detergentes SDS (dodecil sulfato de sódio) e CTAB (brometo de cetiltrimetilamônio). Após a extração, a quantidade de DNA será determinada com Qubit® 2.0 por meio do kit dsDNA HS (Life Technologies, Carlsbad, Califórnia) e espectrofotômetro NanoDrop 2000c (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts). Adicionalmente, as razões de absorção A260/280 e A260/230 serão utilizadas para estimar a pureza do DNA.

Análise de metagenoma:

A composição geral dos organismos bacterianos nas amostras será avaliada pela análise do microbioma. Portanto, usaremos sequenciamento de alto rendimento com a plataforma MiSeq® (Illumina, San Diego, Califórnia). Analisaremos as regiões variáveis ​​V3 e V4 do gene 16S rRNA. Para a classificação filogenética, o rRNA 16S bacteriano será amplificado com os primers 27F (5'-CCT ACG GGN GGC WGC AG-3') e 1391R (5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3').

Análise bioinformática:

A qualidade da execução do Next Generation Sequencing será avaliada usando o software FASTQC 0.11.4. A remoção de bases de baixa qualidade será realizada com o software Trimmomatic-0.35. Para análise de sequência e agrupamento de sequências semelhantes em clusters (OTUs), o pipeline UPARSE será utilizado. Para comparação e análise estatística dos dados do microbioma, usaremos o RStudio (Team 2016) como plataforma com R como linguagem (R Development Core Team 2010) e diferentes pacotes R.