Mikrobiom a imunogenicita slin během ortodontické terapie

Dospělí pacienti (18 let a starší) z klinického oddělení ortodoncie na Univerzitní klinice zubního lékařství ve Vídni budou pozváni k účasti na této pilotní mikrobiologické studii podle definovaných kritérií pro zařazení/vyloučení po udělení souhlasu. Tato studie je pilotním projektem, a proto nebude proveden žádný výpočet velikosti vzorku. Dvacet pacientů bude léčeno vyrovnávacími přípravky Invisalign® a dvacet pacientů dostane multibracketovou terapii. Předchozí mikrobiologická studie prokázala, že lingvální ortodontická terapie má krátkodobý efekt na ústní mikroflóru. Jiná mikrobiální studie kolonizace na zubních implantátech také uvedla bakteriální posun po implantační terapii.

Všichni pacienti dostanou v den shromažďování klinických záznamů instrukce o ústní hygieně. V den, kdy bude pacientovi předložen plán léčby, vyhodnotí Plaque Index vyškolený ortodontista. Pro zahájení léčby je vyžadován index plaku < 20 %. Den před zahájením ortodontické léčby bude proveden odběr vzorku T0 a vyhodnoceny parodontální indexy. Před (T0), po 3 měsících (T1) a po 6 měsících od začátku léčby alignerem nebo držákem bude provedeno klinické vyšetření zahrnující hloubku parodontálního sondování, krvácení při sondování a index plaku (PI). Mikrobiologický odběr bude proveden stimulovaným odběrem slin podle našeho protokolu. Vzorky slin budou rozděleny na alikvoty a skladovány v kryozkumavkách při -80 °C. Molekulární detekce mikroorganismů sekvenováním 16S rDNA genů, sekvenační analýza a taxonomické přiřazení budou prováděny na katedře laboratorní medicíny Lékařské univerzity ve Vídni.

Očekáváme, že sekvenováním 16s rDNA genů se sekvenační analýzou a taxonomickým přiřazením bakterií ve slinách odhalíme možné posuny v mikrobiálních kmenech/rodech mezi různými časovými body. Metagenomické studie se běžně provádějí analýzou genu prokaryotické 16S ribozomální RNA (16S rRNA), který je dlouhý přibližně 1 500 párů bází a obsahuje devět variabilních oblastí rozptýlených mezi konzervované oblasti. Variabilní oblasti 16S rRNA se často používají ve fylogenetických klasifikacích, jako je rod nebo druh v různých mikrobiálních populacích.

Extrakce DNA:

Kvůli lepším kvantitativním a kvalitativním výsledkům ve srovnání s komerčními soupravami pro extrakci DNA bude DNA izolována modifikovanou metodou na bázi chloroformu CTAB SDS. Mechanická analýza bude provedena za použití 1mm kuliček oxidu křemičitého s přídavkem proteinázy K (Qiagen, Venlo, Nizozemsko) a také detergentů SDS (dodecylsulfát sodný) a CTAB (cetyltrimethylamoniumbromid). Po extrakci bude množství DNA stanoveno pomocí Qubit® 2.0 pomocí sady dsDNA HS (Life Technologies, Carlsbad, Kalifornie) a spektrofotometru NanoDrop 2000c (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts). Kromě toho budou k odhadu čistoty DNA použity absorpční poměry A260/280 a A260/230.

Metagenomová analýza:

Celkové složení bakteriálních organismů ve vzorcích bude hodnoceno analýzou mikrobiomu. Proto použijeme vysoce výkonné sekvenování s platformou MiSeq® (Illumina, San Diego, Kalifornie). Budeme analyzovat variabilní oblasti V3 a V4 genu 16S rRNA. Pro fylogenetickou klasifikaci bude bakteriální 16S rRNA amplifikována pomocí primerů 27F (5'-CCT ACG GGN GGC WGC AG-3') a 1391R (5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3').

Bioinformatická analýza:

Kvalita běhu sekvenování nové generace bude hodnocena pomocí softwaru FASTQC 0.11.4. Odstranění nekvalitních podkladů bude provedeno softwarem Trimmomatic-0.35. Pro sekvenční analýzu a shlukování podobných sekvencí do shluků (OTU) bude využito potrubí UPARSE. Pro srovnání a statistickou analýzu dat mikrobiomu použijeme RStudio (Team 2016) jako platformu s jazykem R (R Development Core Team 2010) a různé R-balíčky.