Mikrobiom und Immunogenität des Speichels während der kieferorthopädischen Therapie

Erwachsene Patienten (ab 18 Jahren) aus der Klinischen Abteilung für Kieferorthopädie der Universitätszahnklinik Wien werden zur Teilnahme an dieser mikrobiologischen Pilotstudie nach definierten Ein-/Ausschlusskriterien nach Einwilligung eingeladen. Da es sich bei dieser Studie um ein Pilotprojekt handelt, wird keine Fallzahlberechnung durchgeführt. Zwanzig Patienten werden mit Invisalign®-Alignern behandelt und zwanzig Patienten erhalten eine Multibracket-Therapie. Eine frühere mikrobiologische Studie zeigte, dass eine linguale kieferorthopädische Therapie eine kurzfristige Wirkung auf die orale Mikroflora hat. Eine weitere mikrobielle Studie zur Besiedelung von Zahnimplantaten berichtete ebenfalls über eine bakterielle Verschiebung nach der Implantattherapie.

Alle Patienten erhalten am Tag der Erfassung der Krankenakten eine Einweisung in die Mundhygiene. An dem Tag, an dem dem Patienten der Behandlungsplan vorgelegt wird, wird der Plaque-Index von einem geschulten Kieferorthopäden ausgewertet. Für den Beginn der Behandlung ist ein Plaque-Index von < 20 % erforderlich. Am Tag vor Beginn der kieferorthopädischen Behandlung wird eine T0-Probenentnahme durchgeführt und parodontale Indizes beurteilt. Eine klinische Untersuchung einschließlich parodontaler Sondierungstiefe, Sondierungsblutung und Plaque-Index (PI) wird vor (T0), nach 3 Monaten (T1) und nach 6 Monaten nach Beginn der Aligner- oder Bracket-Therapie durchgeführt. Die mikrobiologische Probenahme erfolgt durch stimulierte Speichelsammlung gemäß unserem Protokoll. Speichelproben werden in Aliquots aufgeteilt und in Kryo-Röhrchen bei -80°C gelagert. Der molekulare Nachweis von Mikroorganismen durch Sequenzierung von 16S rDNA-Genen, Sequenzanalyse und taxonomische Zuordnung wird am Institut für Laboratoriumsmedizin der Medizinischen Universität Wien durchgeführt.

Durch die Sequenzierung von 16s-rDNA-Genen mit Sequenzanalyse und taxonomischer Zuordnung von Bakterien im Speichel erwarten wir, mögliche Verschiebungen in mikrobiellen Phyla/Gattungen zwischen verschiedenen Zeitpunkten aufzudecken. Metagenomische Studien werden üblicherweise durchgeführt, indem das prokaryotische 16S-ribosomale RNA-Gen (16S-rRNA) analysiert wird, das ungefähr 1.500 Basenpaare lang ist und neun variable Regionen enthält, die zwischen konservierten Regionen verteilt sind. Variable Regionen von 16S-rRNA werden häufig in phylogenetischen Klassifikationen wie Gattung oder Art in verschiedenen mikrobiellen Populationen verwendet.

DNA-Extraktion:

Aufgrund besserer quantitativer und qualitativer Ergebnisse im Vergleich zu kommerziellen DNA-Extraktionskits wird die DNA mit einer modifizierten CTAB SDS-Chloroform-basierten Methode isoliert. Die mechanische Analyse wird unter Verwendung von 1-mm-Kieselgelkugeln unter Zugabe von Proteinase K (Qiagen, Venlo, Niederlande) sowie den Detergenzien SDS (Natriumdodecylsulfat) und CTAB (Cetyltrimethylammoniumbromid) durchgeführt. Nach der Extraktion wird die DNA-Menge mit Qubit® 2.0 über das dsDNA HS-Kit (Life Technologies, Carlsbad, Kalifornien) und das Spektrophotometer NanoDrop 2000c (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts) bestimmt. Zusätzlich werden die Absorptionsverhältnisse A260/280 und A260/230 verwendet, um die Reinheit der DNA abzuschätzen.

Metagenomanalyse:

Die Gesamtzusammensetzung der bakteriellen Organismen in den Proben wird durch Analyse des Mikrobioms bewertet. Daher werden wir Hochdurchsatz-Sequenzierung mit der MiSeq®-Plattform (Illumina, San Diego, Kalifornien) verwenden. Wir werden die variablen V3- und V4-Regionen des 16S-rRNA-Gens analysieren. Für die phylogenetische Einordnung wird die bakterielle 16S rRNA mit den Primern 27F (5'-CCT ACG GGN GGC WGC AG-3') und 1391R (5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3') amplifiziert.

Bioinformatische Analyse:

Die Qualität des Next Generation Sequencing-Laufs wird mit der Software FASTQC 0.11.4 bewertet. Die Entfernung minderwertiger Basen erfolgt mit der Software Trimmomatic-0.35 . Für die Sequenzanalyse und das Clustering ähnlicher Sequenzen zu Clustern (OTUs) wird die UPARSE-Pipeline verwendet. Für den Vergleich und die statistische Analyse der Mikrobiomdaten werden wir RStudio (Team 2016) als Plattform mit R als Sprache (R Development Core Team 2010) und verschiedenen R-Paketen verwenden.