Mikrobiom och immunogenitet hos saliv under ortodontisk terapi

Vuxna patienter (18 år och äldre) från Clinical Division of Orthodontics vid University Clinic of Dentistry Vienna kommer att bjudas in att delta i denna mikrobiologiska pilotstudie enligt definierade inklusions-/exkluderingskriterier efter att ha gett sitt samtycke. Denna studie är ett pilotprojekt och därför kommer ingen provstorleksberäkning att göras. Tjugo patienter kommer att behandlas med Invisalign® aligners och tjugo patienter kommer att få multibracket-terapi. En tidigare mikrobiologisk studie visade att lingual ortodontisk terapi har en korttidseffekt på oral mikroflora. En annan mikrobiell studie om kolonisering på tandimplantat rapporterade också bakterieförskjutning efter implantatbehandling.

Alla patienter kommer att få instruktioner i munhygien den dag då kliniska journaler samlas in. Den dag då behandlingsplanen ska presenteras för patienten kommer Plack Index att utvärderas av en utbildad ortodontist. För att påbörja behandlingen krävs ett plackindex på < 20 %. Dagen innan den ortodontiska behandlingen påbörjas kommer T0-provtagning att genomföras och parodontala index kommer att bedömas. En klinisk undersökning inklusive parodontalt sonderingsdjup, blödning vid sondering och plackindex (PI) kommer att utföras före (T0), efter 3 månader (T1) och efter 6 månader efter början av antingen aligner- eller bracketterapi. Mikrobiologisk provtagning kommer att utföras genom stimulerad salivsamling enligt vårt protokoll. Salivprover kommer att delas upp i alikvoter och förvaras i kryorör vid -80°C. Molekylär detektion av mikroorganismer genom sekvensering av 16S rDNA-gener, sekvensanalys och taxonomisk tilldelning kommer att utföras vid Institutionen för laboratoriemedicin vid Medical University of Vienna.

Genom sekvensering av 16s rDNA-gener med sekvensanalys och taxonomisk tilldelning av bakterier i saliv förväntar vi oss att avslöja möjliga förändringar i mikrobiella fyla/släkten mellan olika tidpunkter. Metagenomiska studier utförs vanligtvis genom att analysera den prokaryota 16S ribosomala RNA-genen (16S rRNA), som är cirka 1 500 baspar lång och innehåller nio variabla regioner som är inspridda mellan konserverade regioner. Variabla regioner av 16S rRNA används ofta i fylogenetiska klassificeringar såsom släkte eller arter i olika mikrobiella populationer.

DNA-extraktion:

På grund av bättre kvantitativa och kvalitativa resultat i jämförelse med kommersiella DNA-extraktionssatser, kommer DNA att isoleras med en modifierad CTAB SDS kloroformbaserad metod. Mekanisk analys kommer att utföras med användning av 1 mm kiseldioxidsfärer under tillsats av proteinas K (Qiagen, Venlo, Nederländerna) samt tvättmedlen SDS (natriumdodecylsulfat) och CTAB (cetyltrimetylammoniumbromid). Efter extraktion kommer DNA-kvantiteten att bestämmas med Qubit® 2.0 via dsDNA HS-kitet (Life Technologies, Carlsbad, Kalifornien) och NanoDrop 2000c spektrofotometer (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts). Dessutom kommer absorptionsförhållandena A260/280 och A260/230 att användas för att uppskatta renheten av DNA:t.

Metagenomanalys:

Den övergripande sammansättningen av de bakteriella organismerna i proverna kommer att utvärderas genom att analysera mikrobiom. Därför kommer vi att använda sekvensering med hög genomströmning med MiSeq®-plattformen (Illumina, San Diego, Kalifornien). Vi kommer att analysera de variabla V3- och V4-regionerna av 16S rRNA-genen. För den fylogenetiska klassificeringen kommer det bakteriella 16S-rRNA:t att amplifieras med användning av primers 27F (5'-CCT ACG GGN GGC WGC AG-3') och 1391R (5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3').

Bioinformatisk analys:

Kvaliteten på nästa generations sekvenseringskörning kommer att bedömas med programvaran FASTQC 0.11.4. Borttagningen av baser av låg kvalitet kommer att utföras med programvaran Trimmomatic-0.35 . För sekvensanalys och klustring av liknande sekvenser till kluster (OTU) kommer UPARSE-pipelinen att användas. För jämförelse och statistisk analys av mikrobiomdata kommer vi att använda RStudio (Team 2016) som plattform med R som språk (R Development Core Team 2010) och olika R-paket.