矯正治療中の唾液のマイクロバイオームと免疫原性

ウィーン歯科大学クリニックの矯正歯科臨床部門の成人患者（18歳以上）は、同意を得た後、定義された包含/除外基準に従って、このパイロット微生物学的研究に参加するよう招待されます。 この調査はパイロット プロジェクトであるため、サンプル サイズの計算は行われません。 20 人の患者が Invisalign® アライナーで治療され、20 人の患者がマルチブラケット療法を受けます。 以前の微生物学的研究では、舌側矯正治療が口腔微生物叢に短期的な影響を与えることが示されました。 歯科インプラントでのコロニー形成に関する別の微生物研究でも、インプラント治療による細菌の変化が報告されています。

すべての患者は、臨床記録が収集される日に口腔衛生の指示を受けます。 治療計画が患者に提示される日に、訓練を受けた歯科矯正医がプラーク インデックスを評価します。 治療を開始するには、プラーク指数が 20% 未満である必要があります。 矯正治療開始前日にT0サンプル採取を行い、歯周指標を評価します。 歯周プロービング深度、プロービング時の出血、プラークインデックス (PI) を含む臨床検査は、アライナーまたはブラケット療法のいずれかの開始前 (T0)、3 か月後 (T1)、および 6 か月後に実施されます。 微生物学的サンプリングは、私たちのプロトコルに従って刺激された唾液採取によって行われます。 唾液サンプルは、-80 ° C でクライオ チューブに保存の因数に分割されます。 16S rDNA 遺伝子のシーケンシングによる微生物の分子検出、シーケンシング分析、および分類学的割り当ては、ウィーン医科大学の検査医学部門で行われます。

唾液中の細菌の配列決定分析と分類学的割り当てによる16s rDNA遺伝子の配列決定により、さまざまな時点間の微生物の門/属の可能なシフトを明らかにすることが期待されます。 メタゲノム研究は、通常、原核生物の 16S リボソーム RNA 遺伝子 (16S rRNA) を分​​析することによって行われます。この遺伝子は、約 1,500 塩基対の長さで、保存領域の間に散在する 9 つの可変領域を含んでいます。 16S rRNA の可変領域は、多様な微生物集団の属や種などの系統分類で頻繁に使用されます。

DNA抽出:

市販の DNA 抽出キットと比較して定量的および定性的な結果が優れているため、DNA は修正された CTAB SDS クロロホルムベースの方法で分離されます。 プロテイナーゼＫ（Ｑｉａｇｅｎ、Ｖｅｎｌｏ、オランダ）ならびに界面活性剤ＳＤＳ（ドデシル硫酸ナトリウム）およびＣＴＡＢ（臭化セチルトリメチルアンモニウム）の添加下で、１ｍｍシリカ球を使用して、機械的分析を実施する。 抽出後、dsDNA HSキット（Life Technologies、カリフォルニア州カールスバッド）およびNanoDrop 2000c分光光度計（Thermo Scientific、マサチューセッツ州ウォルサム）を介してQubit®2.0でDNA量を決定します。 さらに、吸収比 A260/280 および A260/230 を使用して、DNA の純度を推定します。

メタゲノム解析:

サンプル中の細菌生物の全体的な構成は、マイクロバイオームを分析することによって評価されます。 したがって、MiSeq® プラットフォーム (イルミナ、カリフォルニア州サンディエゴ) でハイスループット シーケンスを使用します。 16S rRNA 遺伝子の可変 V3 および V4 領域を分析します。 系統分類では、細菌の 16S rRNA は、プライマー 27F (5'-CCT ACG GGN GGC WGC AG-3') および 1391R (5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3') を使用して増幅されます。

バイオインフォマティクス分析:

次世代シーケンシング実行の品質は、ソフトウェア FASTQC 0.11.4 を使用して評価されます。 低品質の塩基の除去は、Trimmomatic-0.35 ソフトウェアで実行されます。 配列分析と類似配列のクラスター化 (OTU) には、UPARSE パイプラインが利用されます。 マイクロバイオーム データの比較と統計分析のために、RStudio (Team 2016) をプラットフォームとして使用し、R を言語 (R Development Core Team 2010) として使用し、さまざまな R パッケージを使用します。