Mikrobiom og immunogenitet av spytt under ortodontisk terapi

Voksne pasienter (18 år og eldre) fra Clinical Division of Orthodontics ved University Clinic of Dentistry Vienna vil bli invitert til å delta i denne mikrobiologiske pilotstudien i henhold til definerte inklusjons-/eksklusjonskriterier etter å ha gitt sitt samtykke. Denne studien er et pilotprosjekt og det vil derfor ikke bli foretatt noen prøvestørrelsesberegning. Tjue pasienter vil bli behandlet med Invisalign® aligners og tjue pasienter vil motta multibracket-terapi. En tidligere mikrobiologisk studie viste at lingual kjeveortopedisk terapi har en kortvarig effekt på oral mikroflora. En annen mikrobiell studie om kolonisering på tannimplantater rapporterte også bakterieskifte etter implantatbehandling.

Alle pasienter vil få instrukser i munnhygiene den dagen kliniske journaler samles. Den dagen behandlingsplanen skal presenteres for pasienten, vil plakkindeksen bli evaluert av en utdannet kjeveortoped. For oppstart av behandlingen kreves en plakkindeks på < 20 %. Dagen før kjeveortopedisk behandling startes, vil T0 prøvetaking bli gjennomført og periodontale indekser vil bli vurdert. En klinisk undersøkelse inkludert periodontal sonderingsdybde, blødning ved sondering og plakkindeks (PI) vil bli utført før (T0), etter 3 måneder (T1) og etter 6 måneder etter begynnelsen av enten aligner- eller brakett-terapi. Mikrobiologisk prøvetaking vil bli utført ved stimulert spyttinnsamling i henhold til vår protokoll. Spyttprøver vil bli delt opp i alikvoter og lagret i kryorør ved -80°C. Molekylær påvisning av mikroorganismer ved sekvensering av 16S rDNA-gener, sekvensanalyse og taksonomisk tildeling vil bli utført ved Institutt for laboratoriemedisin ved Medical University of Vienna.

Ved å sekvensere 16s rDNA-gener med sekvenseringsanalyse og taksonomisk tilordning av bakterier i spytt forventer vi å avsløre mulige skift i mikrobielle fyla/slekter mellom ulike tidspunkt. Metagenomiske studier utføres vanligvis ved å analysere det prokaryote 16S ribosomale RNA-genet (16S rRNA), som er omtrent 1500 basepar langt og inneholder ni variable regioner spredt mellom bevarte regioner. Variable regioner av 16S rRNA brukes ofte i fylogenetiske klassifiseringer som slekt eller arter i forskjellige mikrobielle populasjoner.

DNA-ekstraksjon:

På grunn av bedre kvantitative og kvalitative resultater sammenlignet med kommersielle DNA-ekstraksjonssett, vil DNA bli isolert med en modifisert CTAB SDS kloroform-basert metode. Mekanisk analyse vil bli utført ved bruk av 1 mm silikakuler under tilsetning av proteinase K (Qiagen, Venlo, Nederland) samt vaskemidlene SDS (natriumdodecylsulfat) og CTAB (cetyltrimetylammoniumbromid). Etter ekstraksjon vil DNA-mengden bli bestemt med Qubit® 2.0 via dsDNA HS-settet (Life Technologies, Carlsbad, California) og NanoDrop 2000c spektrofotometer (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts). I tillegg vil absorpsjonsforholdene A260/280 og A260/230 bli brukt for å estimere renheten til DNA.

Metagenomanalyse:

Den samlede sammensetningen av bakterieorganismene i prøvene vil bli evaluert ved å analysere mikrobiom. Derfor vil vi bruke sekvensering med høy gjennomstrømning med MiSeq®-plattformen (Illumina, San Diego, California). Vi vil analysere de variable V3- og V4-regionene til 16S rRNA-genet. For den fylogenetiske klassifiseringen vil bakteriell 16S rRNA bli amplifisert ved bruk av primere 27F (5'-CCT ACG GGN GGC WGC AG-3') og 1391R (5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3').

Bioinformatisk analyse:

Kvaliteten på neste generasjons sekvensering vil bli vurdert ved hjelp av programvaren FASTQC 0.11.4. Fjerning av baser av lav kvalitet vil bli utført med Trimmomatic-0.35-programvaren. For sekvensanalyse og gruppering av lignende sekvenser til klynger (OTU-er) vil UPARSE-rørledningen bli brukt. For sammenligning og statistisk analyse av mikrobiomdataene vil vi bruke RStudio (Team 2016) som plattform med R som språk (R Development Core Team 2010) og ulike R-pakker.