Mikrobiom og immunogenitet af spyt under ortodontisk terapi

Voksne patienter (18 år og ældre) fra den kliniske afdeling for ortodonti ved University Clinic of Dentistry Wien vil blive inviteret til at deltage i denne mikrobiologiske pilotundersøgelse i henhold til definerede inklusions-/eksklusionskriterier efter at have givet deres samtykke. Denne undersøgelse er et pilotprojekt, og der vil derfor ikke blive foretaget en stikprøvestørrelsesberegning. Tyve patienter vil blive behandlet med Invisalign® aligners, og tyve patienter vil modtage multibracket-terapi. En tidligere mikrobiologisk undersøgelse viste, at lingual ortodontisk terapi har en kortvarig effekt på oral mikroflora. En anden mikrobiel undersøgelse af kolonisering på tandimplantater rapporterede også bakterieskift efter implantatbehandling.

Alle patienter vil få instruktioner i mundhygiejne den dag, hvor de kliniske journaler samles. Den dag, hvor behandlingsplanen vil blive præsenteret for patienten, vil Plaque Index blive evalueret af en uddannet ortodontist. Til starten af ​​behandlingen kræves et Plaque Index på < 20 %. Dagen før den ortodontiske behandling påbegyndes, vil T0-prøvetagning blive udført, og parodontale indeks vil blive vurderet. En klinisk undersøgelse, inklusive parodontal sonderingsdybde, blødning ved sondering og plakindeks (PI) vil blive udført før (T0), efter 3 måneder (T1) og efter 6 måneder efter begyndelsen af ​​enten aligner- eller bracket-terapi. Mikrobiologisk prøveudtagning vil blive udført ved stimuleret spytopsamling i henhold til vores protokol. Spytprøver vil blive opdelt i alikvoter og opbevaret i kryorør ved -80°C. Molekylær påvisning af mikroorganismer ved sekventering af 16S rDNA-gener, sekventeringsanalyse og taksonomisk tildeling vil blive udført ved Institut for Laboratoriemedicin ved det medicinske universitet i Wien.

Ved sekventering af 16s rDNA-gener med sekventeringsanalyse og taksonomisk tildeling af bakterier i spyt forventer vi at afsløre mulige skift i mikrobielle phyla/slægter mellem forskellige tidspunkter. Metagenomiske undersøgelser udføres almindeligvis ved at analysere det prokaryote 16S ribosomale RNA-gen (16S rRNA), som er ca. 1.500 basepar langt og indeholder ni variable regioner spredt mellem konserverede regioner. Variable regioner af 16S rRNA bruges ofte i fylogenetiske klassifikationer såsom slægt eller art i forskellige mikrobielle populationer.

DNA ekstraktion:

På grund af bedre kvantitative og kvalitative resultater i sammenligning med kommercielle DNA-ekstraktionssæt, vil DNA blive isoleret med en modificeret CTAB SDS chloroform-baseret metode. Mekanisk analyse vil blive udført ved hjælp af 1 mm silicakugler under tilsætning af proteinase K (Qiagen, Venlo, Holland) samt detergenterne SDS (natriumdodecylsulfat) og CTAB (cetyltrimethylammoniumbromid). Efter ekstraktion vil DNA-mængden blive bestemt med Qubit® 2.0 via dsDNA HS-kittet (Life Technologies, Carlsbad, Californien) og NanoDrop 2000c spektrofotometer (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts). Derudover vil absorptionsforholdene A260/280 og A260/230 blive brugt til at estimere renheden af ​​DNA'et.

Metagenomanalyse:

Den samlede sammensætning af de bakterielle organismer i prøverne vil blive evalueret ved at analysere mikrobiom. Derfor vil vi bruge high throughput sekventering med MiSeq® platformen (Illumina, San Diego, Californien). Vi vil analysere de variable V3- og V4-regioner af 16S rRNA-genet. Til den fylogenetiske klassificering vil det bakterielle 16S rRNA blive amplificeret under anvendelse af primere 27F (5'-CCT ACG GGN GGC WGC AG-3') og 1391R (5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3').

Bioinformatisk analyse:

Kvaliteten af ​​Next Generation Sequencing-kørslen vil blive vurderet ved hjælp af softwaren FASTQC 0.11.4. Fjernelsen af ​​baser af lav kvalitet vil blive udført med Trimmomatic-0.35-softwaren. Til sekvensanalyse og clustering af lignende sekvenser i klynger (OTU'er) vil UPARSE-pipelinen blive brugt. Til sammenligning og statistisk analyse af mikrobiomet data vil vi bruge RStudio (Team 2016) som platform med R som sprog (R Development Core Team 2010) og forskellige R-pakker.