A nyál mikrobiomája és immunogenitása a fogszabályozó terápia során

Felnőtt betegek (18 évesek és idősebbek) a Bécsi Fogászati ​​Egyetem Fogászati ​​Klinika Klinikai Osztályáról meghívást kapnak, hogy részt vegyenek ebben a kísérleti mikrobiológiai vizsgálatban, a meghatározott befogadási/kizárási kritériumok szerint, miután hozzájárulásukat adták. Ez a tanulmány egy kísérleti projekt, ezért nem kerül sor mintaszám-számításra. Húsz beteget kezelnek Invisalign® alignerekkel, húsz beteg pedig multibracket terápiát. Egy korábbi mikrobiológiai vizsgálat kimutatta, hogy a nyelvi fogszabályozó terápia rövid távú hatással van a száj mikroflórájára. Egy másik, a fogászati ​​implantátumokon való kolonizációról szóló mikrobiális tanulmány szintén bakteriális eltolódásról számolt be az implantációs terápia során.

A klinikai feljegyzések összegyűjtésének napján minden beteg utasítást kap a szájhigiéniára vonatkozóan. Azon a napon, amikor a kezelési tervet bemutatják a páciensnek, a plakk indexet képzett fogszabályzó értékeli. A kezelés megkezdéséhez < 20%-os plakk index szükséges. A fogszabályozási kezelés megkezdése előtti napon T0 mintavétel történik és a parodontális indexek felmérése történik. Klinikai vizsgálatot végeznek, amely magában foglalja a parodontális szondázás mélységét, a vérzést a szondázáskor és a plakk indexet (PI) az aligner vagy bracket terápia megkezdése előtt (T0), 3 hónap után (T1) és 6 hónap után. A mikrobiológiai mintavételt stimulált nyálgyűjtéssel végezzük protokollunk szerint. A nyálmintákat alikvot részekre osztják, és krio-csövekben tárolják -80 °C-on. A Bécsi Orvostudományi Egyetem Laboratóriumi Orvostudományi Tanszékén a mikroorganizmusok molekuláris kimutatását 16S rDNS gének szekvenálásával, szekvenciaanalízissel és taxonómiai hozzárendeléssel végzik majd.

A 16s rDNS-gének szekvenálási elemzésével és a nyálban lévő baktériumok taxonómiai besorolásával azt várjuk, hogy feltárjuk a mikrobiális törzsek/nemzetségek lehetséges eltolódásait a különböző időpontok között. A metagenomikai vizsgálatokat általában a prokarióta 16S riboszomális RNS-gén (16S rRNS) elemzésével végzik, amely körülbelül 1500 bázispár hosszú, és kilenc variábilis régiót tartalmaz, amelyek konzervált régiók között vannak elszórva. A 16S rRNS variábilis régióit gyakran használják filogenetikai osztályozásban, például nemzetségek vagy fajok különböző mikrobiális populációiban.

DNS kivonás:

A kereskedelmi DNS extrakciós készletekhez képest jobb mennyiségi és minőségi eredmények miatt a DNS-t módosított CTAB SDS kloroform alapú módszerrel izolálják. A mechanikai elemzést 1 mm-es szilícium-dioxid gömbökkel végzik proteináz K (Qiagen, Venlo, Hollandia), valamint SDS (nátrium-dodecil-szulfát) és CTAB (cetil-trimetil-ammónium-bromid) detergensek hozzáadásával. Az extrakció után a DNS mennyiségét Qubit® 2.0-val határozzuk meg a dsDNA HS kit (Life Technologies, Carlsbad, California) és a NanoDrop 2000c spektrofotométer (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts) segítségével. Ezenkívül az A260/280 és A260/230 abszorpciós arányokat kell használni a DNS tisztaságának becslésére.

Metagenomanalízis:

A mintákban lévő bakteriális organizmusok általános összetételét a mikrobiom elemzésével értékelik. Ezért nagy áteresztőképességű szekvenálást fogunk alkalmazni a MiSeq® platformmal (Illumina, San Diego, California). Elemezzük a 16S rRNS gén variábilis V3 és V4 régióit. A filogenetikai osztályozáshoz a bakteriális 16S rRNS-t a 27F (5'-CCT ACG GGN GGC WGC AG-3') és 1391R (5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3') primerekkel amplifikáljuk.

Bioinformatikai elemzés:

A Next Generation Sequencing futtatásának minőségét a FASTQC 0.11.4 szoftverrel értékeljük. A rossz minőségű alapok eltávolítása a Trimmomatic-0.35 szoftverrel történik. A szekvenciaelemzéshez és a hasonló szekvenciák fürtökbe (OTU-k) való klaszterezéséhez az UPARSE folyamatot használják. A mikrobióm adatok összehasonlításához és statisztikai elemzéséhez az RStudio-t (Team 2016) használjuk platformként, R nyelvvel (R Development Core Team 2010) és különböző R-csomagokkal.