Microbioma e inmunogeneidad de la saliva durante la terapia de ortodoncia

Se invitará a los pacientes adultos (mayores de 18 años) de la División Clínica de Ortodoncia de la Clínica Universitaria de Odontología de Viena a participar en este estudio microbiológico piloto de acuerdo con los criterios de inclusión/exclusión definidos después de dar su consentimiento. Este estudio es un proyecto piloto y, por lo tanto, no se realizará ningún cálculo del tamaño de la muestra. Veinte pacientes serán tratados con alineadores Invisalign® y veinte pacientes recibirán terapia multibracket. Un estudio microbiológico previo mostró que la terapia de ortodoncia lingual tiene un efecto a corto plazo sobre la microflora oral. Otro estudio microbiano sobre la colonización de los implantes dentales también informó de un cambio bacteriano tras la terapia con implantes.

Todos los pacientes recibirán instrucciones en higiene bucal el día que se levante la historia clínica. El día en que se presentará el plan de tratamiento al paciente, un ortodoncista capacitado evaluará el índice de placa. Para el inicio del tratamiento se requiere un Índice de Placa de < 20%. El día anterior al inicio del tratamiento de ortodoncia se realizará la toma de muestra T0 y se evaluarán los índices periodontales. Se realizará un examen clínico que incluya la profundidad de sondaje periodontal, el sangrado al sondaje y el índice de placa (PI) antes (T0), después de 3 meses (T1) y después de 6 meses del comienzo de la terapia con alineadores o brackets. El muestreo microbiológico se realizará mediante recolección de saliva estimulada según nuestro protocolo. Las muestras de saliva se dividirán en alícuotas y se almacenarán en criotubos a -80 °C. La detección molecular de microorganismos mediante secuenciación de genes 16S rDNA, análisis de secuenciación y asignación taxonómica se llevará a cabo en el Departamento de Medicina de Laboratorio de la Universidad de Medicina de Viena.

Mediante la secuenciación de genes de ADNr 16s con análisis de secuenciación y asignación taxonómica de bacterias en la saliva, esperamos revelar posibles cambios en filos/géneros microbianos entre varios puntos temporales. Los estudios metagenómicos se realizan comúnmente mediante el análisis del gen del ARN ribosomal 16S (ARNr 16S) procariótico, que tiene aproximadamente 1500 pares de bases de largo y contiene nueve regiones variables intercaladas entre regiones conservadas. Las regiones variables de 16S rRNA se utilizan con frecuencia en clasificaciones filogenéticas como género o especie en diversas poblaciones microbianas.

Extracción de ADN:

Debido a mejores resultados cuantitativos y cualitativos en comparación con los kits comerciales de extracción de ADN, el ADN se aislará con un método basado en cloroformo CTAB SDS modificado. El análisis mecánico se llevará a cabo utilizando esferas de sílice de 1 mm con la adición de proteinasa K (Qiagen, Venlo, Países Bajos), así como los detergentes SDS (dodecilsulfato de sodio) y CTAB (bromuro de cetiltrimetilamonio). Después de la extracción, la cantidad de ADN se determinará con Qubit® 2.0 a través del kit dsDNA HS (Life Technologies, Carlsbad, California) y el espectrofotómetro NanoDrop 2000c (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts). Además, se utilizarán las relaciones de absorción A260/280 y A260/230 para estimar la pureza del ADN.

Análisis del Metagenoma:

La composición general de los organismos bacterianos en las muestras se evaluará mediante el análisis del microbioma. Por lo tanto, utilizaremos secuenciación de alto rendimiento con la plataforma MiSeq® (Illumina, San Diego, California). Analizaremos las regiones variables V3 y V4 del gen 16S rRNA. Para la clasificación filogenética, se amplificará el rRNA 16S bacteriano utilizando los cebadores 27F (5'-CCT ACG GGN GGC WGC AG-3') y 1391R (5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3').

Análisis bioinformático:

La calidad de la secuenciación de próxima generación se evaluará mediante el software FASTQC 0.11.4. La eliminación de bases de baja calidad se realizará con el software Trimmomatic-0.35. Para el análisis de secuencias y la agrupación de secuencias similares en grupos (OTU), se utilizará la canalización UPARSE. Para la comparación y el análisis estadístico de los datos del microbioma, utilizaremos RStudio (Team 2016) como plataforma con R como lenguaje (R Development Core Team 2010) y diferentes paquetes R.