Microbioom en immunogeniteit van speeksel tijdens orthodontische therapie

Volwassen patiënten (18 jaar en ouder) van de Klinische Afdeling Orthodontie van de Universitaire Kliniek voor Tandheelkunde Wenen zullen na hun toestemming worden uitgenodigd om deel te nemen aan dit microbiologische proefonderzoek volgens gedefinieerde inclusie-/uitsluitingscriteria. Dit onderzoek is een pilotproject en daarom zal er geen berekening van de steekproefomvang worden gemaakt. Twintig patiënten zullen worden behandeld met Invisalign®-aligners en twintig patiënten zullen multibrackettherapie krijgen. Een eerdere microbiologische studie toonde aan dat linguale orthodontische therapie een kortetermijneffect heeft op de orale microflora. Een ander microbieel onderzoek naar kolonisatie op tandheelkundige implantaten meldde ook bacteriële verschuiving na implantaattherapie.

Alle patiënten krijgen instructies over mondhygiëne op de dag dat de klinische dossiers worden verzameld. Op de dag dat het behandelplan aan de patiënt wordt gepresenteerd, wordt de plaque-index beoordeeld door een getrainde orthodontist. Voor de start van de behandeling is een Plaque Index van < 20% vereist. Op de dag voordat de orthodontische behandeling wordt gestart, wordt er een T0-monster afgenomen en worden parodontale indexen beoordeeld. Een klinisch onderzoek inclusief parodontale sonderingsdiepte, bloeding bij sondering en plaque-index (PI) zal worden uitgevoerd vóór (T0), na 3 maanden (T1) en na 6 maanden na het begin van de aligner- of brackettherapie. Microbiologische bemonstering zal worden uitgevoerd door middel van gestimuleerde speekselverzameling volgens ons protocol. Speekselmonsters worden verdeeld in aliquots en opgeslagen in cryobuisjes bij -80°C. Moleculaire detectie van micro-organismen door sequentiebepaling van 16S rDNA-genen, sequentieanalyse en taxonomische toewijzing zullen worden uitgevoerd op de afdeling Laboratoriumgeneeskunde van de Medische Universiteit van Wenen.

Door sequentiebepaling van 16s rDNA-genen met sequentieanalyse en taxonomische toewijzing van bacteriën in speeksel verwachten we mogelijke verschuivingen in microbiële phyla/geslachten tussen verschillende tijdstippen aan het licht te brengen. Metagenomische studies worden gewoonlijk uitgevoerd door analyse van het prokaryote 16S ribosomale RNA-gen (16S rRNA), dat ongeveer 1500 basenparen lang is en negen variabele regio's bevat die zijn afgewisseld tussen geconserveerde regio's. Variabele regio's van 16S-rRNA worden vaak gebruikt in fylogenetische classificaties zoals geslacht of soort in diverse microbiële populaties.

DNA-extractie:

Vanwege betere kwantitatieve en kwalitatieve resultaten in vergelijking met commerciële DNA-extractiekits, zal DNA worden geïsoleerd met een aangepaste CTAB SDS-methode op basis van chloroform. Mechanische analyse zal worden uitgevoerd met behulp van 1 mm silicabolletjes onder toevoeging van proteïnase K (Qiagen, Venlo, Nederland) evenals de detergentia SDS (natriumdodecylsulfaat) en CTAB (cetyltrimethylammoniumbromide). Na extractie wordt de DNA-hoeveelheid bepaald met Qubit® 2.0 via de dsDNA HS-kit (Life Technologies, Carlsbad, Californië) en NanoDrop 2000c-spectrofotometer (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts). Daarnaast zullen de absorptieverhoudingen A260/280 en A260/230 worden gebruikt om de zuiverheid van het DNA te schatten.

Metagenoomanalyse:

De algehele samenstelling van de bacteriële organismen in de monsters zal worden geëvalueerd door het microbioom te analyseren. Daarom zullen we sequencing met hoge doorvoer gebruiken met het MiSeq®-platform (Illumina, San Diego, Californië). We zullen de variabele V3- en V4-regio's van het 16S-rRNA-gen analyseren. Voor de fylogenetische classificatie zal het bacteriële 16S-rRNA worden geamplificeerd met behulp van primers 27F (5'-CCT ACG GGN GGC WGC AG-3') en 1391R (5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3').

Bioinformatische analyse:

De kwaliteit van de Next Generation Sequencing-run wordt beoordeeld met behulp van de software FASTQC 0.11.4. Het verwijderen van basen van lage kwaliteit zal worden uitgevoerd met de software Trimmomatic-0.35. Voor sequentieanalyse en het clusteren van vergelijkbare sequenties in clusters (OTU's) zal de UPARSE-pijplijn worden gebruikt. Voor vergelijking en statistische analyse van de microbioomgegevens gebruiken we RStudio (Team 2016) als platform met R als taal (R Development Core Team 2010) en verschillende R-pakketten.