Syljen mikrobiomi ja immunogeenisyys ortodonttisen hoidon aikana

Aikuiset (18-vuotiaat ja sitä vanhemmat) oikomishoidon kliinisestä osastosta Wienin yliopiston hammaslääketieteen klinikalla kutsutaan osallistumaan tähän mikrobiologiseen pilottitutkimukseen määriteltyjen mukaanotto-/poissulkemiskriteerien mukaisesti saatuaan suostumuksensa. Tämä tutkimus on pilottiprojekti, joten otoskoon laskelmia ei tehdä. Kahdettakymmentä potilasta hoidetaan Invisalign®-linjauslaitteilla ja 20 potilasta multibracket-hoitoa. Aikaisempi mikrobiologinen tutkimus osoitti, että linguaalisella oikomishoidolla on lyhytaikainen vaikutus suun mikroflooraan. Toinen mikrobitutkimus hammasimplanttien kolonisaatiosta raportoi myös bakteerien siirtymisestä implanttihoidon aikana.

Kaikki potilaat saavat ohjeet suuhygieniasta sinä päivänä, kun kliiniset tiedot kerätään. Päivänä, jolloin hoitosuunnitelma esitellään potilaalle, koulutettu oikomislääkäri arvioi plakkiindeksin. Hoidon aloittamiseen vaaditaan < 20 % plakkiindeksi. Oikomishoidon aloitusta edeltävänä päivänä suoritetaan T0-näytteenotto ja periodontaalisten indeksien arviointi. Kliininen tutkimus, joka sisältää parodontaalisen koetussyvyyden, verenvuotoa mittauksen yhteydessä ja plakkiindeksin (PI), suoritetaan ennen (T0), 3 kuukauden kuluttua (T1) ja 6 kuukauden kuluttua joko aligner- tai bracket-hoidon aloittamisesta. Mikrobiologinen näytteenotto suoritetaan stimuloidulla syljenkeräyksellä protokollamme mukaisesti. Sylkinäytteet jaetaan eriin säilytettyinä kryoputkissa -80 °C:ssa. Mikro-organismien molekyylidetektio 16S-rDNA-geenien sekvensoinnilla, sekvensointianalyysi ja taksonominen tehtävä suoritetaan Wienin lääketieteellisen yliopiston laboratoriolääketieteen laitoksella.

Sekvensoimalla 16s rDNA-geenit sekvensointianalyysillä ja syljen bakteerien taksonomisella määrittelyllä odotamme paljastavan mahdollisia muutoksia mikrobien fyla/sukujen välillä eri aikapisteiden välillä. Metagenomiset tutkimukset suoritetaan tavallisesti analysoimalla prokaryoottinen 16S ribosomaalisen RNA-geenin (16S rRNA) pituus, joka on noin 1500 emäsparia ja sisältää yhdeksän muuttuvaa aluetta, jotka on lomitettu konservoituneiden alueiden väliin. 16S rRNA:n vaihtelevia alueita käytetään usein fylogeneettisissa luokitteluissa, kuten suvuissa tai lajeissa erilaisissa mikrobipopulaatioissa.

DNA:n erottaminen:

Koska kvantitatiiviset ja laadulliset tulokset ovat parempia verrattuna kaupallisiin DNA:n erotuspakkauksiin, DNA eristetään modifioidulla CTAB SDS -kloroformipohjaisella menetelmällä. Mekaaninen analyysi suoritetaan käyttämällä 1 mm:n piidioksidipalloja lisäten proteinaasi K:tä (Qiagen, Venlo, Alankomaat) sekä pesuaineita SDS (natriumdodekyylisulfaatti) ja CTAB (setyylitrimetyyliammoniumbromidi). Uuton jälkeen DNA-määrä määritetään Qubit® 2.0:lla dsDNA HS -sarjan (Life Technologies, Carlsbad, California) ja NanoDrop 2000c -spektrofotometrin (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts) kautta. Lisäksi absorptiosuhteita A260/280 ja A260/230 käytetään DNA:n puhtauden arvioimiseen.

Metagenomianalyysi:

Näytteissä olevien bakteeri-organismien kokonaiskoostumus arvioidaan analysoimalla mikrobiomia. Siksi käytämme korkean suorituskyvyn sekvensointia MiSeq®-alustan kanssa (Illumina, San Diego, Kalifornia). Analysoimme 16S-rRNA-geenin vaihtelevia V3- ja V4-alueita. Fylogeneettistä luokittelua varten bakteerien 16S-rRNA monistetaan käyttämällä alukkeita 27F (5'-CCT ACG GGN GGC WGC AG-3') ja 1391R (5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3').

Bioinformaattinen analyysi:

Next Generation Sequencing -ajon laatu arvioidaan FASTQC 0.11.4 -ohjelmistolla. Huonolaatuisten alustojen poisto tehdään Trimmomatic-0.35 ohjelmistolla . Sekvenssianalyysiin ja samankaltaisten sekvenssien klusterointiin klusteriksi (OTU:iksi) käytetään UPARSE-liukuhihnaa. Mikrobiomitietojen vertailuun ja tilastolliseen analysointiin käytämme alustana RStudioa (Team 2016), jossa on R kielenä (R Development Core Team 2010) ja erilaisia ​​R-paketteja.