Microbioma e immunogenicità della saliva durante la terapia ortodontica

I pazienti adulti (dai 18 anni in su) della Divisione Clinica di Ortodonzia presso la Clinica Universitaria di Odontoiatria di Vienna saranno invitati a partecipare a questo studio microbiologico pilota in base a criteri di inclusione/esclusione definiti dopo aver dato il proprio consenso. Questo studio è un progetto pilota e pertanto non verrà effettuato alcun calcolo della dimensione del campione. Venti pazienti saranno trattati con allineatori Invisalign® e venti pazienti riceveranno una terapia multibracket. Un precedente studio microbiologico ha dimostrato che la terapia ortodontica linguale ha un effetto a breve termine sulla microflora orale. Anche un altro studio microbico sulla colonizzazione degli impianti dentali ha riportato uno spostamento batterico dopo la terapia implantare.

Tutti i pazienti riceveranno istruzioni sull'igiene orale il giorno stesso della raccolta delle cartelle cliniche. Il giorno in cui il piano di trattamento sarà presentato al paziente, l'indice di placca sarà valutato da un ortodontista esperto. Per l'inizio del trattamento è richiesto un Indice di Placca < 20%. Il giorno prima dell'inizio del trattamento ortodontico, verrà condotto il prelievo del campione T0 e verranno valutati gli indici parodontali. Prima (T0), dopo 3 mesi (T1) e dopo 6 mesi dall'inizio della terapia con l'allineatore o con il bracket, verrà eseguito un esame clinico che includa la profondità del sondaggio parodontale, il sanguinamento al sondaggio e l'indice di placca (PI). Il campionamento microbiologico sarà eseguito mediante prelievo di saliva stimolata secondo il nostro protocollo. I campioni di saliva saranno suddivisi in aliquote e conservati in criotubi a -80°C. Il rilevamento molecolare dei microrganismi mediante il sequenziamento dei geni 16S rDNA, l'analisi del sequenziamento e l'assegnazione tassonomica saranno eseguiti presso il Dipartimento di Medicina di Laboratorio dell'Università di Medicina di Vienna.

Mediante il sequenziamento dei geni 16s rDNA con l'analisi del sequenziamento e l'assegnazione tassonomica dei batteri nella saliva ci aspettiamo di rivelare possibili spostamenti nei phyla/generi microbici tra vari punti temporali. Gli studi metagenomici vengono comunemente eseguiti analizzando il gene dell'RNA ribosomiale 16S procariotico (16S rRNA), che è lungo circa 1.500 paia di basi e contiene nove regioni variabili intervallate tra regioni conservate. Le regioni variabili dell'rRNA 16S sono spesso utilizzate nelle classificazioni filogenetiche come genere o specie in diverse popolazioni microbiche.

Estrazione del DNA:

Grazie ai migliori risultati quantitativi e qualitativi rispetto ai kit commerciali di estrazione del DNA, il DNA sarà isolato con un metodo basato su cloroformio CTAB SDS modificato. L'analisi meccanica verrà effettuata utilizzando sfere di silice da 1 mm addizionate di proteinasi K (Qiagen, Venlo, Paesi Bassi) nonché i detergenti SDS (sodio dodecil solfato) e CTAB (cetiltrimetilammonio bromuro). Dopo l'estrazione, la quantità di DNA sarà determinata con Qubit® 2.0 tramite il kit dsDNA HS (Life Technologies, Carlsbad, California) e lo spettrofotometro NanoDrop 2000c (Thermo Scientific, Waltham, Massachusetts). Inoltre, i rapporti di assorbimento A260/280 e A260/230 saranno utilizzati per stimare la purezza del DNA.

Analisi del metagenoma:

La composizione complessiva degli organismi batterici nei campioni sarà valutata analizzando il microbioma. Pertanto, utilizzeremo il sequenziamento ad alta produttività con la piattaforma MiSeq® (Illumina, San Diego, California). Analizzeremo le regioni variabili V3 e V4 del gene 16S rRNA. Per la classificazione filogenetica, il 16S rRNA batterico sarà amplificato utilizzando i primer 27F (5'-CCT ACG GGN GGC WGC AG-3') e 1391R (5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3').

Analisi bioinformatica:

La qualità della corsa di Next Generation Sequencing sarà valutata utilizzando il software FASTQC 0.11.4. La rimozione delle basi di bassa qualità verrà effettuata con il software Trimmomatic-0.35. Per l'analisi delle sequenze e il raggruppamento di sequenze simili in cluster (OTU) verrà utilizzata la pipeline UPARSE. Per il confronto e l'analisi statistica dei dati del microbioma utilizzeremo RStudio (Team 2016) come piattaforma con R come linguaggio (R Development Core Team 2010) e diversi pacchetti R.