Микробиом и иммуногенность слюны при ортодонтическом лечении

Взрослые пациенты (18 лет и старше) из клинического отделения ортодонтии Университетской стоматологической клиники Вены будут приглашены для участия в этом пилотном микробиологическом исследовании в соответствии с определенными критериями включения/исключения после их согласия. Это исследование является пилотным проектом, поэтому расчет размера выборки производиться не будет. Двадцать пациентов будут лечить с помощью элайнеров Invisalign®, а двадцать пациентов будут получать мультибрекет-терапию. Предыдущее микробиологическое исследование показало, что лингвальная ортодонтическая терапия оказывает кратковременное влияние на микрофлору полости рта. В другом микробном исследовании колонизации зубных имплантатов также сообщалось о бактериальном сдвиге при имплантационной терапии.

Все пациенты получат инструкции по гигиене полости рта в день сбора истории болезни. В день, когда план лечения будет представлен пациенту, квалифицированный ортодонт оценит индекс зубного налета. Для начала лечения требуется индекс зубного налета < 20%. За день до начала ортодонтического лечения будет проведен сбор проб Т0 и будут оценены пародонтальные индексы. Клиническое обследование, включающее зондирование пародонта на глубину, кровоточивость при зондировании и индекс зубного налета (PI), будет проводиться до (T0), через 3 месяца (T1) и через 6 месяцев после начала лечения элайнерами или брекетами. Микробиологический отбор будет проводиться путем стимулированного сбора слюны в соответствии с нашим протоколом. Образцы слюны будут разделены на аликвоты и храниться в криопробирках при температуре -80°C. Молекулярное обнаружение микроорганизмов путем секвенирования генов 16S рДНК, анализ секвенирования и таксономическое определение будет проводиться на кафедре лабораторной медицины Венского медицинского университета.

Путем секвенирования генов 16s рДНК с анализом секвенирования и таксономической классификацией бактерий в слюне мы ожидаем выявить возможные сдвиги в микробных типах/родах между различными временными точками. Метагеномные исследования обычно проводят путем анализа прокариотического гена рибосомной РНК 16S (16S рРНК), который имеет длину примерно 1500 пар оснований и содержит девять вариабельных областей, перемежающихся между консервативными областями. Вариабельные области 16S рРНК часто используются в филогенетических классификациях, таких как род или вид, в различных микробных популяциях.

Экстракция ДНК:

Благодаря лучшим количественным и качественным результатам по сравнению с коммерческими наборами для выделения ДНК, ДНК будет выделяться модифицированным методом CTAB SDS на основе хлороформа. Механический анализ будет проводиться с использованием кремнеземных сфер диаметром 1 мм с добавлением протеиназы К (Qiagen, Venlo, Нидерланды), а также детергентов SDS (додецилсульфат натрия) и CTAB (бромид цетилтриметиламмония). После выделения количество ДНК будет определяться с помощью Qubit® 2.0 с помощью набора HS dsDNA (Life Technologies, Карлсбад, Калифорния) и спектрофотометра NanoDrop 2000c (Thermo Scientific, Уолтем, Массачусетс). Кроме того, коэффициенты поглощения A260/280 и A260/230 будут использоваться для оценки чистоты ДНК.

Метагеномный анализ:

Общий состав бактериальных организмов в образцах будет оцениваться путем анализа микробиома. Поэтому мы будем использовать высокопроизводительное секвенирование с платформой MiSeq® (Illumina, Сан-Диего, Калифорния). Мы проанализируем вариабельные области V3 и V4 гена 16S рРНК. Для филогенетической классификации бактериальная 16S рРНК будет амплифицирована с использованием праймеров 27F (5'-CCT ACG GGN GGC WGC AG-3') и 1391R (5'-GACTACHVGGGTATCTAATCC-3').

Биоинформационный анализ:

Качество запуска секвенирования следующего поколения будет оцениваться с использованием программного обеспечения FASTQC 0.11.4. Удаление некачественных баз будет производиться программой Trimmomatic-0.35. Для анализа последовательностей и объединения похожих последовательностей в кластеры (OTU) будет использоваться конвейер UPARSE. Для сравнения и статистического анализа данных микробиома мы будем использовать RStudio (Team 2016) в качестве платформы с R в качестве языка (R Development Core Team 2010) и различные R-пакеты.