PCR-CRISPR/Cas12a对露天肺炎患者早期抗感染方案的影响

ICU患者下呼吸道细菌感染发生率高，以重症肺炎为主，常引起严重败血症和感染性休克，是患者死亡的主要原因之一。 目前临床医生面临的最大困难是由于早期经验性抗感染治疗不足导致细菌耐药率不断升高和患者死亡率增加。 研究表明，VAP（Ventilator Associated Pneumonia）患者早期存在不合理用药，死亡率超过50%。 当合理用药率下降到33%时，机械通气时间和ICU住院时间都明显缩短。 因此，尽早查明病原体，缩短经验性抗感染治疗时间，对于改善重症肺炎患者预后、降低细菌耐药发生率具有重要意义。

传统的病原微生物检测方法有以下三种： 1.微生物培养法是最传统的病原体鉴定手段。 需要将患者的体液、血液等接种在合适的培养基中，在合适的培养箱中培养，然后传药。 药敏试验确定微生物的耐药性，通常需要3-7天。 对于某些特定种类的病原微生物或生长条件苛刻的微生物，可能会出现阴性培养结果。 因此，传统的培养方法存在时效性差、要求相对较高、培养阳性率低（30-40%）等缺点。 2.飞行时间质谱法：利用质谱技术对菌株的蛋白质成分进行分析检测，得到特征峰谱。 与数据库中的细菌图谱进行比对，可以通过匹配来判断细菌。 该方法与常规培养法相比可缩短约6-8小时，但由于菌落检测需要达到一定数量，获取标本后不能直接检测，初步微生物培养是必需的。 因此，检测时间仍需1-2天或更长时间，同时也存在时效性不高的缺点。 此外，还要对比数据库的扩充和标准化，不能分析微生物的耐药性也是检测技术的不足。 3. 高通量测序技术：近年来随着分子生物学的快速发展，高通量测序技术广泛应用于临床微生物的早期诊断，其原理主要是通过通用接头连接到片段化来被排序。 基因组DNA，产生数以千万计的单分子多克隆聚合酶链反应阵列，然后进行大规模的引物杂交和酶延伸反应，通过计算机分析得到完整的DNA序列信息。 但该技术难以有效区分致病菌和背景菌，技术和数据库有待规范，检测时间尚需2天左右，无法获得微生物耐药性，价格昂贵等缺点。 综上所述，目前靶向抗感染治疗的时限为取标本后2天。 因此，寻找新的更快、更准确、更灵敏的病原微生物检测技术是近年来微生物和抗感染研究领域的热点和难点。

南京大学生命科学学院研发的肺泡灌洗液PCR-CRISPR/Cas12a组合技术，基于PCR扩增和荧光信号二次检测，实现检测样本中特定DNA序列的存在与否。 技术。 临床标本病原体检测结果的判定是以标本DNAD的PCR产物荧光结果与阳性对照（PC）和阴性对照（NC）荧光检测结果的比对为标准. CRISPR/Cas12a系统的特异性识别功能依赖于crRNA与特定DNA的特异性引导和结合，而crRNA的特异性是由单个crRNA检测常见病原体的阳性对照决定的。 该检测技术特异性强，仅需2-3小时，与常规技术相比，检测时间有了质的飞跃。

为验证该技术的可行性和准确性，本中心与南京生命科学大学针对ICU肺炎的常见病原体（鲍曼不动杆菌、MRSA、肺炎克雷伯菌、铜绿假单胞菌等）对肺泡进行了初步研究。灌洗液PCR-CRISPR/Cas12a联合检测技术。 采用常规细菌培养法结合PCR-CRISPR/Cas12a对29份下呼吸道肺泡灌洗液标本进行培养。 结果表明，基于PCR-Cas12a技术的病原体检测鉴定准确率达到93.10%（27/29）。 对于27份标本，采用PCR-CRISPR/Cas12a技术可检测出传统分离培养法感染的病原体。 两个例外分别是传统分离培养法在6号样品中检出鲍曼不动杆菌和在13号样品中检出奇异变形杆菌（不在检出病原体范围内）。 而且，PCR-CRISPR/Cas12a联合技术鉴定出的病原体与传统培养方法的差异不止一两个，这与PCR一致，表明其灵敏度远高于常规微生物培养，并且结果可靠。 这些初步结果表明，PCR-CRISPR/Cas12a联合检测技术具有良好的准确性和高灵敏度。

据此，研究团队推测，结合肺泡灌洗液PCR和CRISPR/Cas12a检测技术指导肺炎患者的抗感染治疗，可以实现靶向抗感染治疗，改善患者预后。 为验证上述假设，我们设计了一项多中心随机前瞻性研究，比较PCR-CRISPR/Cas12a联合检测肺泡灌洗液与传统微生物检测技术对ICU肺炎患者抗菌药物调整及预后的影响。 旨在为肺炎患者寻找更快速、准确、灵敏的微生物检测技术，实现更早的精准治疗。