Effet de la PCR-CRISPR/Cas12a sur les schémas anti-infectieux précoces chez les patients atteints de pneumonie à ciel ouvert

Les patients en soins intensifs ont une incidence élevée d'infection bactérienne dans les voies respiratoires inférieures, principalement avec une pneumonie sévère, provoquant souvent une septicémie sévère et un choc septique, qui est l'une des principales causes de décès chez les patients. A l'heure actuelle, la plus grande difficulté rencontrée par les cliniciens est l'augmentation continue du taux de résistance bactérienne et l'augmentation de la mortalité des patients due à l'insuffisance précoce des traitements anti-infectieux empiriques. Des études ont montré que les patients atteints de VAP (Ventilator Associated Pneumonia) ont une consommation irrationnelle de médicaments au stade précoce, avec un taux de mortalité de plus de 50 %. Lorsque le taux d'utilisation appropriée des médicaments est tombé à 33%, alors que le temps de ventilation mécanique et le temps d'hospitalisation en USI ont été considérablement raccourcis. Par conséquent, l'identification des agents pathogènes le plus tôt possible et le raccourcissement de la durée du traitement anti-infectieux empirique sont très importants pour améliorer le pronostic des patients atteints de pneumonie sévère et réduire l'incidence de la résistance bactérienne.

Il existe trois méthodes traditionnelles de détection des micro-organismes pathogènes : 1. la méthode de culture microbienne est le moyen le plus traditionnel d'identification des agents pathogènes. Il est nécessaire d'ensemencer le liquide corporel, le sang, etc. du patient dans un milieu approprié, de l'incuber dans un incubateur approprié, puis de faire passer le médicament. Les tests de sensibilité déterminent la résistance des micro-organismes, prend généralement 3-7 jours. Pour certains types spécifiques de micro-organismes pathogènes ou de micro-organismes avec des conditions de croissance difficiles, il peut y avoir des résultats de culture négatifs. Par conséquent, les méthodes de culture traditionnelles présentent des inconvénients tels qu'une rapidité d'exécution médiocre, des exigences relativement élevées et un faible taux de culture positive (30 à 40%). 2. spectrométrie de masse à temps de vol : la technique de spectrométrie de masse est utilisée pour analyser et détecter les composants protéiques de la souche, et le spectre de pic caractéristique est obtenu. Par rapport à la carte bactérienne de la base de données, les bactéries peuvent être jugées par appariement. La méthode peut être raccourcie d'environ 6 à 8 heures par rapport à la méthode de culture conventionnelle, mais comme la détection de la colonie doit atteindre une certaine quantité, l'échantillon ne peut pas être directement détecté après l'obtention de l'échantillon, et la culture microbienne préliminaire est obligatoire. Par conséquent, le temps de détection prend encore 1 à 2 jours ou plus, et il y a aussi l'inconvénient d'une faible rapidité. De plus, il est nécessaire de comparer l'expansion et la normalisation de la base de données, et l'incapacité d'analyser la résistance des micro-organismes est également l'insuffisance de la technologie de détection. 3. Technologie de séquençage à haut débit : Avec le développement rapide de la biologie moléculaire ces dernières années, la technologie de séquençage à haut débit est largement utilisée dans le diagnostic précoce de la microbiologie clinique, le principe passe principalement par la connexion du lieur universel à la fragmentation pour être séquencé. L'ADN génomique, qui produit des dizaines de millions de matrices de réaction en chaîne par polymérase polyclonale à molécule unique, effectue ensuite des réactions d'hybridation d'amorce et d'extension enzymatique à grande échelle, et obtient des informations complètes sur la séquence d'ADN par analyse informatique. Cependant, cette technologie est difficile à distinguer efficacement entre les bactéries pathogènes et les bactéries de fond, la technologie et la base de données doivent être normalisées, le temps de détection prend encore environ 2 jours, ne peut pas obtenir de résistance microbienne, coûteux et autres lacunes au bureau. En résumé, le délai actuel de traitement anti-infectieux ciblé est arrêté 2 jours après le prélèvement du prélèvement. Par conséquent, la recherche d'une nouvelle technologie de détection microbienne pathogène plus rapide, plus précise et plus sensible est un point chaud et un point difficile dans le domaine de la recherche microbienne et anti-infectieuse ces dernières années.

La technologie de combinaison PCR-CRISPR/Cas12a du liquide de lavage alvéolaire développée par le College of Life Sciences de l'Université de Nanjing est basée sur l'amplification PCR et la détection du signal de fluorescence deux fois pour obtenir la détection de la présence et de l'absence de séquences d'ADN spécifiques dans l'échantillon de test. La technologie. La détermination du résultat de détection de l'agent pathogène de l'échantillon clinique est basée sur la comparaison des résultats de fluorescence du produit PCR de l'échantillon DNAD avec les résultats de détection de fluorescence du contrôle positif (PC) et du contrôle négatif (NC) comme standard. . La fonction de reconnaissance spécifique du système CRISPR/Cas12a repose sur le guidage spécifique et la liaison du crRNA à un ADN spécifique, et la spécificité du crRNA est déterminée par la détection d'un contrôle positif d'un pathogène commun par un seul crRNA. La technologie de détection est très spécifique et ne prend que 2 à 3 heures, ce qui représente un saut qualitatif dans le temps de détection par rapport à la technologie conventionnelle.

Afin de vérifier la faisabilité et l'exactitude de la technologie, le Centre et l'Université des sciences de la vie de Nanjing pour les agents pathogènes courants de la pneumonie en soins intensifs (Acinetobacter baumannii, SARM, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, etc.) pour alvéolaire Une étude préliminaire de la Technique de détection combinée PCR-CRISPR/Cas12a pour le liquide de lavage. Vingt-neuf échantillons de liquide de lavage alvéolaire des voies respiratoires inférieures ont été cultivés par la méthode de culture bactérienne conventionnelle et combinés avec PCR-CRISPR/Cas12a. Les résultats ont montré que la précision de détection et d'identification des agents pathogènes basée sur la technologie PCR-Cas12a atteignait 93,10 % (27/29). Pour les 27 échantillons, les pathogènes infectés par la méthode de culture d'isolement traditionnelle peuvent être détectés par la technologie PCR-CRISPR/Cas12a. Les deux exceptions étaient la détection d'Acinetobacter baumannii dans l'échantillon n° 6 par la méthode de culture d'isolement traditionnelle et la détection de Proteus mirabilis dans l'échantillon n° 13 (hors de la plage des agents pathogènes détectés). De plus, les agents pathogènes identifiés par la technique combinée PCR-CRISPR/Cas12a étaient plus d'un ou deux différents des méthodes de culture traditionnelles, ce qui était cohérent avec la PCR, suggérant que la sensibilité est bien supérieure à celle de la culture microbienne conventionnelle, et la les résultats sont fiables. Ces résultats préliminaires indiquent que la technique de détection combinée PCR-CRISPR/Cas12a a une bonne précision et une sensibilité élevée.

Sur cette base, l'équipe de recherche a émis l'hypothèse que la combinaison de la PCR et de la technologie de détection CRISPR/Cas12a du liquide de lavage alvéolaire pour guider le traitement anti-infectieux des patients atteints de pneumonie peut atteindre un traitement anti-infectieux ciblé et améliorer le pronostic du patient. Pour valider l'hypothèse ci-dessus, nous avons conçu une étude prospective randomisée multicentrique comparant les effets de la détection combinée PCR-CRISPR/Cas12a avec le liquide de lavage alvéolaire et les techniques de détection microbienne traditionnelles sur l'ajustement antimicrobien et le pronostic chez les patients atteints de pneumonie en USI. Il vise à trouver une technologie de détection microbienne plus rapide, précise et sensible pour les patients atteints de pneumonie et à obtenir un traitement de précision plus précoce.