PCR-CRISPR/Cas12a:n vaikutus varhaisiin infektiontorjuntajärjestelmiin potilailla, joilla on ulkoilmakeuhkokuume

Tehohoitopotilailla on suuri ilmaantuvuus alempien hengitysteiden bakteeri-infektioihin, pääasiassa vaikeaan keuhkokuumeeseen, joka usein aiheuttaa vakavan sepsiksen ja septisen shokin, joka on yksi potilaiden tärkeimmistä kuolinsyistä. Tällä hetkellä suurin kliinikoiden kohtaama vaikeus on bakteerien vastustuskyvyn jatkuva kasvu ja potilaiden kuolleisuuden kasvu johtuen varhaisesta riittämättömyydestä empiiriseen infektionvastaiseen hoitoon. Tutkimukset ovat osoittaneet, että VAP (Ventilator Associated Pneumonia) -potilailla on irrationaalinen huumeiden käyttö varhaisessa vaiheessa, ja kuolleisuus on yli 50 %. Kun tarkoituksenmukaisen huumeiden käyttöaste on pudonnut 33 prosenttiin, kun taas koneellinen hengitysaika ja teho-osaston sairaalahoitoaika ovat lyhentyneet merkittävästi. Siksi taudinaiheuttajien mahdollisimman varhainen tunnistaminen ja empiirisen infektionvastaisen hoidon ajan lyhentäminen ovat erittäin tärkeitä vaikeasta keuhkokuumeesta kärsivien potilaiden ennusteen parantamiseksi ja bakteeriresistenssin ilmaantuvuuden vähentämiseksi.

Patogeenisten mikro-organismien havaitsemiseen on kolme perinteistä menetelmää: 1. Mikrobiviljelymenetelmä on perinteisin tapa tunnistaa taudinaiheuttaja. Potilaan kehon neste, veri jne. on rokotettava sopivassa väliaineessa, inkuboitava sopivassa inkubaattorissa ja sitten lääkitys. Herkkyystesteillä määritetään mikro-organismien vastustuskyky, kestää yleensä 3-7 päivää. Joillekin tietyntyyppisille patogeenisille mikro-organismeille tai mikro-organismeille, joilla on ankarat kasvuolosuhteet, viljelytulokset voivat olla negatiivisia. Siksi perinteisillä viljelymenetelmillä on haittoja, kuten huono ajantasaisuus, suhteellisen korkeat vaatimukset ja alhainen positiivinen viljelyaste (30-40 %). 2. Lentoajan massaspektrometria: massaspektrometriaa käytetään kannan proteiinikomponenttien analysointiin ja havaitsemiseen, jolloin saadaan tunnusomainen huippuspektri. Verrattuna tietokannan bakteerikarttaan, bakteerit voidaan arvioida vastaavuudella. Menetelmää voidaan lyhentää noin 6-8 tunnilla tavanomaiseen viljelymenetelmään verrattuna, mutta koska pesäkkeen havaitsemisen on saavutettava tietty määrä, näytettä ei voida suoraan havaita näytteenoton jälkeen ja alustava mikrobiviljely on edellytetään. Siksi havaitsemisaika kestää edelleen 1-2 päivää tai enemmän, ja haittapuolena on myös alhainen oikea-aikaisuus. Lisäksi on tarpeen verrata tietokannan laajenemista ja standardointia, ja kyvyttömyys analysoida mikro-organismien vastustuskykyä on myös havaitsemistekniikan riittämättömyys. 3. Korkean suorituskyvyn sekvensointitekniikka: Molekyylibiologian nopean kehityksen myötä viime vuosina korkean suorituskyvyn sekvensointitekniikkaa käytetään laajalti kliinisen mikrobiologian varhaisessa diagnosoinnissa, periaate on pääasiassa yhdistämällä universaali linkkeri pirstoutumiseen olla järjestyksessä. Genominen DNA, joka tuottaa kymmeniä miljoonia yksimolekyylisiä polyklonaalisia polymeraasiketjureaktioryhmiä, suorittaa sitten laajamittaisia ​​alukehybridisaatio- ja entsyymipidennysreaktioita ja saa täydelliset DNA-sekvenssitiedot tietokoneanalyysillä. Tämä tekniikka on kuitenkin vaikea erottaa tehokkaasti patogeeniset bakteerit ja taustabakteerit, teknologia ja tietokanta on standardoitava, havaitsemisaika kestää vielä noin 2 päivää, ei voi saada mikrobien vastustuskykyä, kalliita ja muita puutteita Toimistolla. Yhteenvetona voidaan todeta, että nykyinen kohdennetun infektionvastaisen hoidon aikaraja pysähtyy 2 päivää näytteen ottamisen jälkeen. Siksi uuden, nopeamman, tarkemman ja herkemmän patogeenisten mikrobien havaitsemisteknologian etsintä on viime vuosien hotspot ja vaikea kohta mikrobien ja infektioiden vastaisen tutkimuksen alalla.

Nanjingin yliopiston College of Life Sciences -yliopiston kehittämä alveolaarisen huuhtelunesteen PCR-CRISPR/Cas12a-yhdistelmätekniikka perustuu PCR-monistukseen ja fluoresenssisignaalin havaitsemiseen kahdesti, jotta saavutetaan spesifisten DNA-sekvenssien läsnäolon ja puuttumisen havaitseminen testinäytteessä. teknologiaa. Kliinisen näytteen patogeenin havaitsemistuloksen määrittäminen perustuu näytteen DNAD:n PCR-tuotteen fluoresenssitulosten vertailuun positiivisen kontrollin (PC) ja negatiivisen kontrollin (NC) fluoresenssin havaitsemistulosten kanssa standardina. . CRISPR/Cas12a-järjestelmän spesifinen tunnistustoiminto perustuu crRNA:n spesifiseen ohjaukseen ja sitoutumiseen spesifiseen DNA:han, ja crRNA:n spesifisyys määritetään havaitsemalla yhteisen patogeenin positiivinen kontrolli yhdellä crRNA:lla. Havaintotekniikka on erittäin spesifinen ja kestää vain 2-3 tuntia, mikä on laadullinen harppaus havaitsemisajassa verrattuna perinteiseen tekniikkaan.

Tekniikan toteutettavuuden ja tarkkuuden varmistamiseksi keskus ja Nanjingin biotieteiden yliopisto tekivät ICU-keuhkokuumeen yleisten patogeenien (Acinetobacter baumannii, MRSA, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa jne.) keuhkorakkuloiden esitutkimuksen. PCR-CRISPR/Cas12a yhdistetty tunnistustekniikka huuhtelunesteelle. 29 näytettä alempien hengitysteiden alveolaarisesta huuhtelunesteestä viljeltiin tavanomaisella bakteeriviljelymenetelmällä ja yhdistettiin PCR-CRISPR/Cas12a:n kanssa. Tulokset osoittivat, että PCR-Cas12a-teknologiaan perustuva patogeenien havaitsemisen ja tunnistamisen tarkkuus oli 93,10 % (27/29). Perinteisellä eristysviljelymenetelmällä tartunnan saaneet patogeenit voidaan havaita 27 näytteestä PCR-CRISPR/Cas12a-tekniikalla. Kaksi poikkeusta olivat Acinetobacter baumannii -bakteerin havaitseminen näytteestä nro 6 perinteisellä eristysviljelymenetelmällä ja Proteus mirabilis -bakteerin havaitseminen näytteestä nro 13 (ei havaittujen patogeenien rajoissa). Lisäksi PCR-CRISPR/Cas12a-yhdistelmätekniikalla tunnistetut patogeenit olivat enemmän kuin kaksi erilaista kuin perinteiset viljelymenetelmät, mikä oli yhdenmukainen PCR:n kanssa, mikä viittaa siihen, että herkkyys on paljon suurempi kuin tavanomaisen mikrobiviljelmän herkkyys. tulokset ovat luotettavia. Nämä alustavat tulokset osoittavat, että yhdistetyllä PCR-CRISPR/Cas12a-ilmaisutekniikalla on hyvä tarkkuus ja korkea herkkyys.

Näiden perusteella tutkimusryhmä arveli, että alveolaarisen huuhtelunesteen PCR:n ja CRISPR/Cas12a-havaitsemistekniikan yhdistelmällä keuhkokuumepotilaiden infektioiden vastaista hoitoa voidaan saavuttaa kohdennettu anti-infektiivinen hoito ja parantaa potilaan ennustetta. Yllä olevan hypoteesin vahvistamiseksi suunnittelimme monikeskuksen satunnaistetun prospektiivisen tutkimuksen, jossa verrataan PCR-CRISPR/Cas12a yhdistetyn havaitsemisen vaikutuksia alveolaarisen huuhtelunesteen ja perinteisten mikrobien havaitsemistekniikoiden kanssa antimikrobiseen säätöön ja ennusteeseen teho-osaston keuhkokuumepotilailla. Sen tavoitteena on löytää nopeampaa, tarkempaa ja herkempää mikrobien havaitsemistekniikkaa keuhkokuumepotilaille ja saavuttaa aikaisempi tarkkuushoito.