Efecto de la PCR-CRISPR/Cas12a en los esquemas antiinfecciosos tempranos en pacientes con neumonía al aire libre

Los pacientes de la UCI tienen una alta incidencia de infección bacteriana en el tracto respiratorio inferior, principalmente con neumonía grave, que a menudo causa sepsis severa y shock séptico, que es una de las principales causas de muerte en los pacientes. En la actualidad, la mayor dificultad a la que se enfrentan los clínicos es el aumento continuo de la tasa de resistencia bacteriana y el aumento de la mortalidad de los pacientes debido a la inadecuación temprana del tratamiento antiinfeccioso empírico. Los estudios han demostrado que los pacientes con VAP (neumonía asociada al ventilador) tienen un uso irracional de drogas en la etapa temprana, con una tasa de mortalidad de más del 50%. Cuando la tasa de uso apropiado de medicamentos se ha reducido al 33%, mientras que el tiempo de ventilación mecánica y el tiempo de hospitalización en la UCI se han reducido significativamente. Por tanto, identificar los patógenos lo antes posible y acortar el tiempo de tratamiento antiinfeccioso empírico es muy importante para mejorar el pronóstico de los pacientes con neumonía grave y reducir la incidencia de resistencias bacterianas.

Existen tres métodos tradicionales para detectar microorganismos patógenos: 1. El método de cultivo microbiano es el medio más tradicional para identificar patógenos. Es necesario inocular el fluido corporal, la sangre, etc. del paciente en un medio adecuado, incubar en una incubadora adecuada y luego pasar el medicamento. Las pruebas de sensibilidad determinan la resistencia de los microorganismos, por lo general toma de 3 a 7 días. Para algunos tipos específicos de microorganismos patógenos o microorganismos con condiciones de crecimiento difíciles, puede haber resultados de cultivo negativos. Por lo tanto, los métodos de cultivo tradicionales tienen desventajas como poca puntualidad, requisitos relativamente altos y una baja tasa de cultivo positivo (30-40%). 2. espectrometría de masas de tiempo de vuelo: la técnica de espectrometría de masas se utiliza para analizar y detectar los componentes proteicos de la cepa, y se obtiene el espectro de pico característico. En comparación con el mapa bacteriano en la base de datos, las bacterias se pueden juzgar por coincidencia. El método se puede acortar entre 6 y 8 horas en comparación con el método de cultivo convencional, pero dado que la detección de la colonia debe alcanzar una cierta cantidad, la muestra no se puede detectar directamente después de obtener la muestra, y el cultivo microbiano preliminar es requerido. Por lo tanto, el tiempo de detección aún toma de 1 a 2 días o más, y también existe la desventaja de la poca puntualidad. Además, es necesario comparar la expansión y estandarización de la base de datos, y la incapacidad para analizar la resistencia de los microorganismos es también la insuficiencia de la tecnología de detección. 3. Tecnología de secuenciación de alto rendimiento: con el rápido desarrollo de la biología molecular en los últimos años, la tecnología de secuenciación de alto rendimiento se usa ampliamente en el diagnóstico temprano de la microbiología clínica, el principio es principalmente a través de la conexión del enlazador universal a la fragmentación para ser secuenciado. El ADN genómico, que produce decenas de millones de matrices de reacción en cadena de la polimerasa policlonal de una sola molécula, luego realiza hibridación de cebadores a gran escala y reacciones de extensión de enzimas, y obtiene información completa de la secuencia de ADN mediante análisis informático. Sin embargo, esta tecnología es difícil de distinguir de manera efectiva entre bacterias patógenas y bacterias de fondo, la tecnología y la base de datos deben estandarizarse, el tiempo de detección aún toma alrededor de 2 días, no se puede obtener resistencia microbiana, costosas y otras deficiencias en la oficina. En resumen, el límite de tiempo actual para el tratamiento antiinfeccioso dirigido se detiene 2 días después de la toma de la muestra. Por lo tanto, la búsqueda de una nueva tecnología de detección microbiana patógena que sea más rápida, más precisa y más sensible es un punto crítico y un punto difícil en el campo de la investigación microbiana y antiinfecciosa en los últimos años.

La tecnología de combinación PCR-CRISPR/Cas12a de líquido de lavado alveolar desarrollada por la Facultad de Ciencias de la Vida de la Universidad de Nanjing se basa en la amplificación por PCR y la detección de señales de fluorescencia dos veces para lograr la detección de la presencia y ausencia de secuencias específicas de ADN en la muestra de prueba. tecnología. La determinación del resultado de detección del patógeno de la muestra clínica se basa en la comparación de los resultados de fluorescencia del producto de PCR de la muestra DNAD con los resultados de detección de fluorescencia del control positivo (PC) y el control negativo (NC) como estándar. . La función de reconocimiento específico del sistema CRISPR/Cas12a se basa en la guía específica y la unión del crRNA a un ADN específico, y la especificidad del crRNA se determina mediante la detección de un control positivo de un patógeno común por un solo crRNA. La tecnología de detección es muy específica y tarda solo 2-3 horas, lo que supone un salto cualitativo en el tiempo de detección respecto a la tecnología convencional.

Para verificar la viabilidad y precisión de la tecnología, el Centro y la Universidad de Ciencias de la Vida de Nanjing para los patógenos comunes de la neumonía en la UCI (Acinetobacter baumannii, MRSA, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, etc.) para alveolar Un estudio preliminar de la Técnica de detección combinada PCR-CRISPR/Cas12a para líquido de lavado. Veintinueve muestras de líquido de lavado alveolar del tracto respiratorio inferior se cultivaron mediante el método de cultivo bacteriano convencional y se combinaron con PCR-CRISPR/Cas12a. Los resultados mostraron que la precisión de detección e identificación de patógenos basada en la tecnología PCR-Cas12a alcanzó el 93,10% (27/29). Para las 27 muestras, los patógenos infectados por el método de cultivo de aislamiento tradicional pueden detectarse mediante la tecnología PCR-CRISPR/Cas12a. Las dos excepciones fueron la detección de Acinetobacter baumannii en la muestra No. 6 por el método tradicional de cultivo de aislamiento y la detección de Proteus mirabilis en la muestra No. 13 (no dentro del rango de patógenos detectados). Además, los patógenos identificados por la técnica de combinación PCR-CRISPR/Cas12a fueron más de uno o dos diferentes a los métodos de cultivo tradicionales, lo que fue consistente con la PCR, lo que sugiere que la sensibilidad es mucho mayor que la del cultivo microbiano convencional, y la los resultados son confiables. Estos resultados preliminares indican que la técnica de detección combinada PCR-CRISPR/Cas12a tiene buena precisión y alta sensibilidad.

En base a eso, el equipo de investigación especuló que la combinación de PCR y tecnología de detección CRISPR/Cas12a del líquido de lavado alveolar para guiar el tratamiento antiinfeccioso de los pacientes con neumonía puede lograr un tratamiento antiinfeccioso específico y mejorar el pronóstico del paciente. Para validar la hipótesis anterior, diseñamos un estudio prospectivo aleatorizado multicéntrico que compara los efectos de la detección combinada de PCR-CRISPR/Cas12a con líquido de lavado alveolar y las técnicas tradicionales de detección microbiana sobre el ajuste antimicrobiano y el pronóstico en pacientes con neumonía en la UCI. Su objetivo es encontrar una tecnología de detección microbiana más rápida, precisa y sensible para pacientes con neumonía y lograr un tratamiento de precisión más temprano.