Effekt av PCR-CRISPR/Cas12a på de tidiga anti-infektionsprogrammen hos patienter med lunginflammation utomhus

ICU-patienter har en hög förekomst av bakteriell infektion i de nedre luftvägarna, främst med svår lunginflammation, som ofta orsakar svår sepsis och septisk chock, vilket är en av de främsta dödsorsakerna hos patienter. För närvarande är den största svårigheten för kliniker den kontinuerliga ökningen av bakteriell resistensfrekvens och ökningen av patientdödlighet på grund av den tidiga otillräckliga empiriska anti-infektionsbehandlingen. Studier har visat att patienter med VAP (Ventilator Associated Pneumonia) har irrationell droganvändning i ett tidigt skede, med en dödlighet på mer än 50 %. När frekvensen av lämplig droganvändning har sjunkit till 33 %, medan tiden för mekanisk ventilation och sjukhusvårdstid för intensivvård har förkortats avsevärt. Därför är det mycket viktigt att identifiera patogener så tidigt som möjligt och förkorta tiden för empirisk anti-infektionsbehandling för att förbättra prognosen för patienter med svår lunginflammation och minska förekomsten av bakteriell resistens.

Det finns tre traditionella metoder för att upptäcka patogena mikroorganismer: 1. Mikrobiell odlingsmetod är det mest traditionella sättet att identifiera patogen. Det är nödvändigt att inokulera patientens kroppsvätska, blod etc. i ett lämpligt medium, inkubera i en lämplig inkubator och sedan passera läkemedlet. Känslighetstester bestämmer resistens hos mikroorganismer, tar vanligtvis 3-7 dagar. För vissa specifika typer av patogena mikroorganismer eller mikroorganismer med svåra tillväxtförhållanden kan det finnas negativa odlingsresultat. Därför har de traditionella odlingsmetoderna nackdelar som dålig aktualitet, relativt höga krav och låg positiv odlingshastighet (30-40%). 2. Time-of-flight-masspektrometri: masspektrometritekniken används för att analysera och detektera stammens proteinkomponenter, och det karakteristiska toppspektrumet erhålls. Jämfört med bakteriekartan i databasen kan bakterierna bedömas genom matchning. Metoden kan förkortas med cirka 6-8 timmar jämfört med den konventionella odlingsmetoden, men eftersom detektionen av kolonin behöver nå en viss mängd kan provet inte detekteras direkt efter att provet tagits, och den preliminära mikrobiella odlingen är nödvändig. Därför tar detektionstiden fortfarande 1-2 dagar eller mer, och det finns också nackdelen med låg aktualitet. Dessutom är det nödvändigt att jämföra utbyggnaden och standardiseringen av databasen, och oförmågan att analysera resistensen hos mikroorganismer är också otillräckligheten i detektionstekniken. 3. High-throughput sekvenseringsteknik: Med den snabba utvecklingen av molekylärbiologi under de senaste åren, är high-throughput sekvenseringsteknik flitigt använd i tidig diagnos av klinisk mikrobiologi, principen är främst genom anslutningen av den universella länken till fragmenteringen till sekvenseras. Genomiskt DNA, som producerar tiotals miljoner enkelmolekylära polyklonala polymeraskedjereaktionsuppsättningar, utför sedan storskaliga primerhybridiserings- och enzymförlängningsreaktioner och erhåller fullständig DNA-sekvensinformation genom datoranalys. Men denna teknik är svår att effektivt skilja mellan patogena bakterier och bakgrundsbakterier, teknik och databas som ska standardiseras, detektionstiden tar fortfarande cirka 2 dagar, kan inte få mikrobiell resistens, dyra och andra brister På kontoret. Sammanfattningsvis stoppas den nuvarande tidsgränsen för riktad anti-infektionsbehandling 2 dagar efter att provet tagits. Därför är sökandet efter ny, patogen mikrobiell detektionsteknologi som är snabbare, mer exakt och känsligare en hotspot och en svår punkt inom området för mikrobiell och anti-infektionsforskning de senaste åren.

PCR-CRISPR/Cas12a-kombinationsteknologin av alveolär sköljvätska utvecklad av College of Life Sciences vid Nanjing University är baserad på PCR-amplifiering och fluorescenssignaldetektion två gånger för att uppnå detektion av närvaro och frånvaro av specifika DNA-sekvenser i testprovet. teknologi. Bestämningen av detektionsresultatet för den kliniska provpatogenen baseras på jämförelsen av fluorescensresultaten för PCR-produkten från DNAD-provet med fluorescensdetekteringsresultaten för den positiva kontrollen (PC) och den negativa kontrollen (NC) som standard . Den specifika igenkänningsfunktionen för CRISPR/Cas12a-systemet är beroende av den specifika vägledningen och bindningen av crRNA till specifikt DNA, och specificiteten för crRNA bestäms genom detektion av en positiv kontroll av en vanlig patogen av ett enda crRNA. Detektionstekniken är mycket specifik och tar bara 2-3 timmar, vilket är ett kvalitativt steg i detektionstiden jämfört med den konventionella tekniken.

För att verifiera genomförbarheten och noggrannheten av tekniken, Center och Nanjing University of Life Sciences för de vanliga patogenerna av ICU-lunginflammation (Acinetobacter baumannii, MRSA, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, etc.) för alveolär A preliminär studie av PCR-CRISPR/Cas12a kombinerad detektionsteknik för sköljvätska. Tjugonio prover av alveolär sköljvätska i de nedre luftvägarna odlades med konventionell bakterieodlingsmetod och kombinerades med PCR-CRISPR/Cas12a. Resultaten visade att noggrannheten för detektion och identifiering av patogener baserad på PCR-Cas12a-teknologi nådde 93,10 % (27/29). För de 27 proverna kan patogenerna infekterade med den traditionella isoleringsodlingsmetoden detekteras med PCR-CRISPR/Cas12a-teknologi. De två undantagen var detektering av Acinetobacter baumannii i prov nr 6 med den traditionella isoleringsodlingsmetoden och detektering av Proteus mirabilis i prov nr 13 (inte inom intervallet för patogener som upptäckts). Dessutom var patogenerna som identifierades med PCR-CRISPR/Cas12a-kombinationstekniken mer än en eller två olika de traditionella odlingsmetoderna, vilket var förenligt med PCR, vilket tyder på att känsligheten är mycket högre än den för konventionell mikrobiell kultur, och resultaten är tillförlitliga. Dessa preliminära resultat indikerar att PCR-CRISPR/Cas12a kombinerad detektionsteknik har god noggrannhet och hög känslighet.

Baserat på dessa spekulerade forskargruppen att kombinationen av PCR och CRISPR/Cas12a-detektionsteknologi av alveolär sköljvätska för att vägleda anti-infektionsbehandling av lunginflammationspatienter kan uppnå riktad anti-infektionsbehandling och förbättra patientens prognos. För att validera ovanstående hypotes designade vi en multicenter randomiserad prospektiv studie som jämförde effekterna av PCR-CRISPR/Cas12a kombinerad detektion med alveolär sköljvätska och traditionella mikrobiell detektionstekniker på antimikrobiell justering och prognos hos patienter med ICU-lunginflammation. Syftet är att hitta snabbare, exakt och känsligare mikrobiell detektionsteknologi för patienter med lunginflammation, och att uppnå tidigare precisionsbehandling.