Effect van PCR-CRISPR/Cas12a op de vroege anti-infectieuze schema's bij patiënten met longontsteking in de open lucht

IC-patiënten hebben een hoge incidentie van bacteriële infectie in de onderste luchtwegen, voornamelijk met ernstige longontsteking, die vaak ernstige sepsis en septische shock veroorzaakt, wat een van de belangrijkste doodsoorzaken bij patiënten is. Op dit moment is de grootste moeilijkheid waarmee clinici worden geconfronteerd de voortdurende toename van de bacteriële resistentie en de toename van de mortaliteit van de patiënt als gevolg van de vroegtijdige ontoereikendheid van de empirische anti-infectieuze behandeling. Studies hebben aangetoond dat patiënten met VAP (Ventilator Associated Pneumonia) in een vroeg stadium irrationeel drugsgebruik hebben, met een sterftecijfer van meer dan 50%. Wanneer het percentage gepast drugsgebruik is gedaald tot 33%, terwijl de tijd voor mechanische beademing en ziekenhuisopname op de IC aanzienlijk zijn verkort. Daarom zijn het zo vroeg mogelijk identificeren van pathogenen en het verkorten van de tijd van empirische anti-infectieuze behandeling erg belangrijk voor het verbeteren van de prognose van patiënten met ernstige longontsteking en het verminderen van de incidentie van bacteriële resistentie.

Er zijn drie traditionele methoden voor het detecteren van pathogene micro-organismen: 1. De microbiële kweekmethode is de meest traditionele manier om pathogenen te identificeren. Het is noodzakelijk om de lichaamsvloeistof, het bloed, enz. Van de patiënt in een geschikt medium te inoculeren, in een geschikte incubator te incuberen en vervolgens het medicijn door te geven. Gevoeligheidstests bepalen de weerstand van micro-organismen, duurt meestal 3-7 dagen. Voor sommige specifieke soorten pathogene micro-organismen of micro-organismen met moeilijke groeiomstandigheden kunnen er negatieve kweekresultaten zijn. Daarom hebben de traditionele cultuurmethoden nadelen zoals slechte tijdigheid, relatief hoge vereisten en een laag positief cultuurpercentage (30-40%). 2. time-of-flight massaspectrometrie: de massaspectrometrische techniek wordt gebruikt om de eiwitcomponenten van de stam te analyseren en te detecteren, en het karakteristieke piekspectrum wordt verkregen. Vergeleken met de bacteriekaart in de database kunnen de bacteriën worden beoordeeld door te matchen. De methode kan met ongeveer 6-8 uur worden verkort in vergelijking met de conventionele kweekmethode, maar aangezien de detectie van de kolonie een bepaalde hoeveelheid moet bereiken, kan het monster niet direct worden gedetecteerd na het verkrijgen van het monster en is de voorbereidende microbiële cultuur vereist. vereist. Daarom duurt de detectietijd nog steeds 1-2 dagen of langer, en er is ook het nadeel van een lage tijdigheid. Daarnaast is het nodig om de uitbreiding en standaardisatie van de database te vergelijken, en het onvermogen om de weerstand van micro-organismen te analyseren is ook de ontoereikendheid van de detectietechnologie. 3. High-throughput sequencing-technologie: met de snelle ontwikkeling van de moleculaire biologie in de afgelopen jaren, wordt high-throughput sequencing-technologie veel gebruikt bij de vroege diagnose van klinische microbiologie, het principe is voornamelijk door de verbinding van de universele linker met de fragmentatie om worden gesequenced. Genomisch DNA, dat tientallen miljoenen single-molecule polyklonale polymerasekettingreactie-arrays produceert, voert vervolgens grootschalige primerhybridisatie- en enzymverlengingsreacties uit en verkrijgt volledige DNA-sequentie-informatie door computeranalyse. Deze technologie is echter moeilijk om effectief onderscheid te maken tussen pathogene bacteriën en achtergrondbacteriën, technologie en database moeten worden gestandaardiseerd, de detectietijd duurt nog steeds ongeveer 2 dagen, kan geen microbiële resistentie verkrijgen, dure en andere tekortkomingen op kantoor. Samengevat, de huidige tijdslimiet voor gerichte anti-infectieuze behandeling stopt 2 dagen nadat het monster is genomen. Daarom is de zoektocht naar nieuwe, pathogene microbiële detectietechnologie die sneller, nauwkeuriger en gevoeliger is, de afgelopen jaren een hotspot en een moeilijk punt op het gebied van microbieel en anti-infectieus onderzoek.

De PCR-CRISPR/Cas12a-combinatietechnologie van alveolaire lavagevloeistof, ontwikkeld door het College of Life Sciences van Nanjing University, is gebaseerd op PCR-amplificatie en tweemaal fluorescentiesignaaldetectie om de detectie van de aanwezigheid en afwezigheid van specifieke DNA-sequenties in het testmonster te bereiken. technologie. De bepaling van het detectieresultaat van de klinische monsterpathogeen is gebaseerd op de vergelijking van de fluorescentieresultaten van het PCR-product van het DNAD-monster met de fluorescentiedetectieresultaten van de positieve controle (PC) en de negatieve controle (NC) als standaard . De specifieke herkenningsfunctie van het CRISPR/Cas12a-systeem berust op de specifieke geleiding en binding van het crRNA aan specifiek DNA, en de specificiteit van het crRNA wordt bepaald door detectie van een positieve controle van een gemeenschappelijk pathogeen door een enkel crRNA. De detectietechnologie is zeer specifiek en neemt slechts 2-3 uur in beslag, wat een kwalitatieve sprong is in de detectietijd ten opzichte van de conventionele technologie.

Om de haalbaarheid en nauwkeurigheid van de technologie te verifiëren, hebben het Centrum en de Nanjing University of Life Sciences voor de veel voorkomende pathogenen van ICU-pneumonie (Acinetobacter baumannii, MRSA, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, etc.) voor alveolaire Een voorstudie van de PCR-CRISPR/Cas12a gecombineerde detectietechniek voor lavagevloeistof. Negenentwintig monsters van alveolaire lavagevloeistof van de onderste luchtwegen werden gekweekt met de conventionele bacteriekweekmethode en gecombineerd met PCR-CRISPR/Cas12a. De resultaten toonden aan dat de nauwkeurigheid van detectie en identificatie van ziekteverwekkers op basis van PCR-Cas12a-technologie 93,10% bereikte (27/29). Voor de 27 exemplaren kunnen de ziekteverwekkers die zijn geïnfecteerd met de traditionele isolatiecultuurmethode worden gedetecteerd met PCR-CRISPR/Cas12a-technologie. De twee uitzonderingen waren de detectie van Acinetobacter baumannii in monster nr. 6 met de traditionele isolatiekweekmethode en de detectie van Proteus mirabilis in monster nr. 13 (niet binnen het bereik van gedetecteerde pathogenen). Bovendien waren de pathogenen geïdentificeerd door de PCR-CRISPR/Cas12a-combinatietechniek meer dan een of twee verschillend van de traditionele kweekmethoden, wat consistent was met de PCR, wat suggereert dat de gevoeligheid veel hoger is dan die van conventionele microbiële kweek, en de resultaten zijn betrouwbaar. Deze voorlopige resultaten geven aan dat de PCR-CRISPR/Cas12a gecombineerde detectietechniek een goede nauwkeurigheid en hoge gevoeligheid heeft.

Op basis daarvan speculeerde het onderzoeksteam dat de combinatie van PCR en CRISPR/Cas12a-detectietechnologie van alveolaire lavagevloeistof om anti-infectieuze behandeling van longontstekingpatiënten te begeleiden, een gerichte anti-infectieuze behandeling kan bereiken en de prognose van de patiënt kan verbeteren. Om de bovenstaande hypothese te valideren, hebben we een multicenter gerandomiseerde prospectieve studie ontworpen waarin de effecten van PCR-CRISPR/Cas12a gecombineerde detectie met alveolaire lavagevloeistof en traditionele microbiële detectietechnieken op antimicrobiële aanpassing en prognose bij patiënten met ICU-pneumonie worden vergeleken. Het doel is om snellere, nauwkeurigere en gevoeligere microbiële detectietechnologie te vinden voor patiënten met longontsteking, en om een ​​eerdere precisiebehandeling te bereiken.