PCR-CRISPR/Cas12a가 야외폐렴 환자의 초기 항감염 기법에 미치는 영향

중환자실 환자는 하기도 세균감염의 발생률이 높으며, 주로 중증 폐렴을 동반하여 중증 패혈증 및 패혈성 쇼크를 일으키는 경우가 많으며, 이는 환자의 주요 사망 원인 중 하나이다. 현재 임상의들이 직면한 가장 큰 어려움은 초기의 경험적 항감염 치료 미흡으로 인한 세균 내성률의 지속적인 증가와 환자 사망률의 증가이다. 연구에 따르면 VAP(인공호흡기 관련 폐렴) 환자는 초기에 비합리적인 약물 사용으로 사망률이 50% 이상인 것으로 나타났습니다. 적절한 약물 사용률이 33%로 떨어졌을 때 기계 환기 시간과 ICU 입원 시간이 크게 단축되었습니다. 따라서 중증 폐렴 환자의 예후를 개선하고 세균 내성 발생률을 낮추기 위해서는 조기에 병원체를 파악하고 경험적 항감염 치료 시간을 단축하는 것이 매우 중요하다.

병원성 미생물을 검출하는 세 가지 전통적인 방법이 있습니다. 1. 미생물 배양 방법은 병원체를 식별하는 가장 전통적인 방법입니다. 환자의 체액, 혈액 등을 적당한 배지에 접종하여 적당한 배양기에서 배양한 후 약물을 통과시키는 것이 필요하다. 민감도 테스트는 미생물의 저항성을 결정하며 일반적으로 3-7일이 소요됩니다. 일부 특정 유형의 병원성 미생물 또는 가혹한 성장 조건을 가진 미생물의 경우 음성 배양 결과가 있을 수 있습니다. 따라서 전통적 배양방법은 적시성 부족, 상대적으로 높은 요구사항, 낮은 양성배양율(30~40%) 등의 단점을 가지고 있다. 2. time-of-flight 질량 분석법: 질량 분석법을 사용하여 균주의 단백질 성분을 분석 및 검출하고 특징적인 피크 스펙트럼을 얻습니다. 데이터베이스의 세균 지도와 비교하여 세균을 매칭하여 판단할 수 있습니다. 기존의 배양법에 비해 약 6-8시간 단축이 가능하나, 콜로니 검출이 일정량에 도달해야 하므로 검체 채취 후 직접 검체를 검출할 수 없으며, 예비 미생물 배양은 필수의. 따라서 탐지 시간은 여전히 ​​1~2일 이상 소요되며 적시성이 낮은 단점도 있다. 또한 데이터베이스의 확장과 표준화에 대한 비교가 필요하며, 미생물의 저항성을 분석하지 못하는 것도 검출기술의 미비이다. 3. High-throughput sequencing 기술: 최근 몇 년 동안 분자 생물학의 급속한 발전과 함께 high-throughput sequencing 기술은 임상 미생물학의 조기 진단에 널리 사용되며 원칙은 주로 단편화에 대한 범용 링커의 연결을 통해 시퀀싱한다. 수천만 개의 단분자 다클론 중합효소 연쇄반응 어레이를 생산하는 게놈 DNA는 대규모 프라이머 혼성화 및 효소 확장 반응을 수행하고 컴퓨터 분석을 통해 완전한 DNA 서열 정보를 얻습니다. 그러나 이 기술은 병원성 세균과 배경 세균을 효과적으로 구별하기 어렵고, 기술 및 데이터베이스를 표준화해야 하고, 검출 시간은 여전히 ​​2일 정도 소요되며, 미생물 내성을 얻을 수 없고, 비용이 많이 드는 등의 단점이 있어 사무실에서 사용하고 있다. 요약하면, 표적 항감염 치료에 대한 현재 제한 시간은 검체를 채취한 후 2일 후에 중단됩니다. 따라서, 보다 빠르고 정확하며 민감한 새로운 병원성 미생물 검출 기술에 대한 탐색은 최근 몇 년 동안 미생물 및 항감염 연구 분야에서 핫스팟이자 어려운 지점입니다.

난징대학교 생명과학대학에서 개발한 폐포세척액의 PCR-CRISPR/Cas12a 조합 기술은 PCR 증폭 및 형광 신호 검출을 2회 수행하여 테스트 샘플에서 특정 DNA 서열의 유무를 검출합니다. 기술. 임상검체 병원균 검출결과의 판단은 양성대조군(PC)과 음성대조군(NC)의 형광 검출결과를 기준으로 시료 DNAD의 PCR 산물의 형광결과를 비교하여 판단한다. . CRISPR/Cas12a 시스템의 특정 인식 기능은 특정 DNA에 대한 crRNA의 특정 안내 및 결합에 의존하며 crRNA의 특이성은 단일 crRNA에 의한 공통 병원체의 양성 대조군 검출에 의해 결정됩니다. 탐지 기술은 매우 특이적이고 2~3시간 밖에 걸리지 않아 기존 기술에 비해 탐지 시간이 질적으로 향상되었습니다.

기술의 타당성과 정확성을 검증하기 위해 센터와 남경생명과학대학은 폐포에 대한 ICU 폐렴의 공통 병원체(Acinetobacter baumannii, MRSA, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa 등)에 대한 예비 연구를 수행했다. 세척액에 대한 PCR-CRISPR/Cas12a 결합 검출 기술. 29개의 하기도폐포세척액 검체를 기존의 세균배양법으로 배양하여 PCR-CRISPR/Cas12a와 결합하였다. 그 결과 PCR-Cas12a 기술을 기반으로 한 병원체 검출 및 동정 정확도는 93.10%(27/29)에 달했다. 27개 검체에 대해 기존의 분리배양법으로 감염된 병원체를 PCR-CRISPR/Cas12a 기술로 검출할 수 있다. 두 가지 예외는 전통적인 분리 배양 방법에 의한 6번 시료의 Acinetobacter baumannii 검출과 13번 시료의 Proteus mirabilis 검출(검출된 병원균 범위에 속하지 않음)이었다. 또한 PCR-CRISPR/Cas12a 조합법으로 동정된 병원체는 기존의 배양법보다 한두 가지 이상 상이하여 PCR과 일치하여 기존 미생물 배양법보다 민감도가 훨씬 높으며, 결과는 신뢰할 수 있습니다. 이러한 예비 결과는 PCR-CRISPR/Cas12a 결합 검출 기술이 우수한 정확도와 높은 감도를 가지고 있음을 나타냅니다.

이를 바탕으로 연구팀은 PCR과 폐포세척액의 CRISPR/Cas12a 검출 기술을 결합해 폐렴 환자의 항감염 치료 가이드를 제시하면 표적 항감염 치료를 달성하고 환자의 예후를 개선할 수 있을 것으로 추측했다. 위의 가설을 검증하기 위해 우리는 PCR-CRISPR/Cas12a 결합 검출과 폐포 세척액 및 전통적인 미생물 검출 기술이 ICU 폐렴 환자의 항균 조정 및 예후에 미치는 영향을 비교하는 다기관 무작위 전향 연구를 설계했습니다. 폐렴 환자를 위한 보다 빠르고 정확하며 민감한 미생물 검출 기술을 찾아 조기 정밀 치료를 이루는 것을 목표로 한다.