Effetto della PCR-CRISPR/Cas12a sugli schemi antinfettivi precoci nei pazienti con polmonite ad aria aperta

I pazienti in terapia intensiva hanno un'alta incidenza di infezione batterica nel tratto respiratorio inferiore, principalmente con polmonite grave, che spesso causa sepsi grave e shock settico, che è una delle principali cause di morte nei pazienti. Allo stato attuale, la maggiore difficoltà affrontata dai medici è il continuo aumento del tasso di resistenza batterica e l'aumento della mortalità dei pazienti a causa della precoce inadeguatezza del trattamento antinfettivo empirico. Gli studi hanno dimostrato che i pazienti con VAP (polmonite associata a ventilazione) hanno un uso irrazionale di droghe nella fase iniziale, con un tasso di mortalità superiore al 50%. Quando il tasso di uso appropriato di droghe è sceso al 33%, mentre il tempo di ventilazione meccanica e il tempo di ricovero in terapia intensiva sono stati notevolmente ridotti. Pertanto, identificare i patogeni il prima possibile e accorciare i tempi del trattamento antinfettivo empirico sono molto importanti per migliorare la prognosi dei pazienti con polmonite grave e ridurre l'incidenza della resistenza batterica.

Esistono tre metodi tradizionali per rilevare i microrganismi patogeni: 1. Il metodo di coltura microbica è il mezzo più tradizionale per identificare l'agente patogeno. È necessario inoculare il fluido corporeo, il sangue, ecc. del paziente in un mezzo adatto, incubare in un'incubatrice adatta e quindi far passare il farmaco. I test di sensibilità determinano la resistenza dei microrganismi, di solito richiedono 3-7 giorni. Per alcuni tipi specifici di microrganismi patogeni o microrganismi con condizioni di crescita difficili, potrebbero esserci risultati di coltura negativi. Pertanto, i metodi di coltura tradizionali presentano svantaggi quali scarsa tempestività, requisiti relativamente elevati e basso tasso di coltura positiva (30-40%). 2. spettrometria di massa a tempo di volo: la tecnica della spettrometria di massa viene utilizzata per analizzare e rilevare i componenti proteici del ceppo e si ottiene lo spettro di picco caratteristico. Rispetto alla mappa batterica nel database, i batteri possono essere giudicati in base alla corrispondenza. Il metodo può essere ridotto di circa 6-8 ore rispetto al metodo di coltura convenzionale, ma poiché il rilevamento della colonia deve raggiungere una certa quantità, il campione non può essere rilevato direttamente dopo aver ottenuto il campione e la coltura microbica preliminare è necessario. Pertanto, il tempo di rilevamento richiede ancora 1-2 giorni o più, e c'è anche lo svantaggio di una scarsa tempestività. Inoltre, è necessario confrontare l'espansione e la standardizzazione del database e l'incapacità di analizzare la resistenza dei microrganismi è anche l'inadeguatezza della tecnologia di rilevamento. 3. Tecnologia di sequenziamento ad alto rendimento: con il rapido sviluppo della biologia molecolare negli ultimi anni, la tecnologia di sequenziamento ad alto rendimento è ampiamente utilizzata nella diagnosi precoce della microbiologia clinica, il principio è principalmente attraverso la connessione del linker universale alla frammentazione a essere sequenziato. Il DNA genomico, che produce decine di milioni di array di reazioni a catena della polimerasi policlonali a singola molecola, esegue quindi l'ibridazione dei primer su larga scala e le reazioni di estensione degli enzimi e ottiene informazioni complete sulla sequenza del DNA mediante analisi al computer. Tuttavia, questa tecnologia è difficile da distinguere efficacemente tra batteri patogeni e batteri di fondo, tecnologia e database da standardizzare, il tempo di rilevamento richiede ancora circa 2 giorni, non può ottenere resistenza microbica, carenze costose e altre in ufficio. In sintesi, l'attuale limite di tempo per il trattamento antinfettivo mirato viene interrotto 2 giorni dopo il prelievo del campione. Pertanto, la ricerca di una nuova tecnologia di rilevamento microbico patogeno che sia più veloce, più accurata e più sensibile è un punto caldo e un punto difficile nel campo della ricerca microbica e anti-infettiva negli ultimi anni.

La tecnologia combinata PCR-CRISPR/Cas12a del fluido di lavaggio alveolare sviluppata dal College of Life Sciences dell'Università di Nanjing si basa sull'amplificazione PCR e sul rilevamento del segnale di fluorescenza due volte per ottenere il rilevamento della presenza e dell'assenza di specifiche sequenze di DNA nel campione di prova. tecnologia. La determinazione del risultato di rilevamento del patogeno del campione clinico si basa sul confronto dei risultati di fluorescenza del prodotto PCR del DNAD del campione con i risultati di rilevamento della fluorescenza del controllo positivo (PC) e del controllo negativo (NC) come standard . La specifica funzione di riconoscimento del sistema CRISPR/Cas12a si basa sulla guida specifica e sul legame del crRNA al DNA specifico e la specificità del crRNA è determinata dal rilevamento di un controllo positivo di un comune patogeno da parte di un singolo crRNA. La tecnologia di rilevamento è altamente specifica e richiede solo 2-3 ore, il che rappresenta un salto di qualità nel tempo di rilevamento rispetto alla tecnologia convenzionale.

Al fine di verificare la fattibilità e l'accuratezza della tecnologia, il Centro e la Nanjing University of Life Sciences per i patogeni comuni della polmonite in terapia intensiva (Acinetobacter baumannii, MRSA, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, ecc.) per alveolare Uno studio preliminare della Tecnica di rilevazione combinata PCR-CRISPR/Cas12a per fluido di lavaggio. Ventinove campioni di fluido di lavaggio alveolare del tratto respiratorio inferiore sono stati coltivati ​​con il metodo di coltura batterica convenzionale e combinati con PCR-CRISPR/Cas12a. I risultati hanno mostrato che l'accuratezza del rilevamento e dell'identificazione dei patogeni basata sulla tecnologia PCR-Cas12a ha raggiunto il 93,10% (27/29). Per i 27 campioni, i patogeni infettati con il metodo tradizionale della coltura di isolamento possono essere rilevati mediante tecnologia PCR-CRISPR/Cas12a. Le due eccezioni sono state il rilevamento di Acinetobacter baumannii nel campione n. 6 mediante il metodo tradizionale della coltura di isolamento e il rilevamento di Proteus mirabilis nel campione n. 13 (non all'interno della gamma di agenti patogeni rilevati). Inoltre, i patogeni identificati dalla tecnica di combinazione PCR-CRISPR/Cas12a erano più di uno o due diversi rispetto ai metodi di coltura tradizionali, il che era coerente con la PCR, suggerendo che la sensibilità è molto più elevata di quella della coltura microbica convenzionale e il i risultati sono affidabili. Questi risultati preliminari indicano che la tecnica di rilevazione combinata PCR-CRISPR/Cas12a ha una buona accuratezza e un'elevata sensibilità.

Sulla base di questi, il team di ricerca ha ipotizzato che la combinazione della tecnologia di rilevamento PCR e CRISPR/Cas12a del fluido di lavaggio alveolare per guidare il trattamento anti-infettivo dei pazienti con polmonite possa ottenere un trattamento anti-infettivo mirato e migliorare la prognosi del paziente. Per convalidare l'ipotesi di cui sopra, abbiamo progettato uno studio prospettico randomizzato multicentrico confrontando gli effetti del rilevamento combinato PCR-CRISPR/Cas12a con il liquido di lavaggio alveolare e le tradizionali tecniche di rilevamento microbico sull'aggiustamento antimicrobico e sulla prognosi nei pazienti con polmonite in terapia intensiva. Ha lo scopo di trovare una tecnologia di rilevamento microbico più rapida, accurata e sensibile per i pazienti con polmonite e di ottenere un trattamento di precisione precoce.