Effekt af PCR-CRISPR/Cas12a på de tidlige anti-infektionsordninger hos patienter med lungebetændelse i åben luft

ICU-patienter har en høj forekomst af bakteriel infektion i de nedre luftveje, hovedsageligt med svær lungebetændelse, der ofte forårsager alvorlig sepsis og septisk shock, som er en af ​​de vigtigste dødsårsager hos patienter. På nuværende tidspunkt er den største vanskelighed for klinikere den kontinuerlige stigning i bakteriel resistensrate og stigningen i patientdødelighed på grund af den tidlige utilstrækkelighed empirisk anti-infektionsbehandling. Undersøgelser har vist, at patienter med VAP (Ventilator Associated Pneumonia) har irrationel stofbrug i det tidlige stadie med en dødelighed på mere end 50 %. Når antallet af passende stofbrug er faldet til 33 %, mens mekanisk ventilationstid og ICU indlæggelsestid er blevet væsentligt forkortet. Derfor er det meget vigtigt at identificere patogener så tidligt som muligt og afkorte tiden for empirisk anti-infektionsbehandling for at forbedre prognosen for patienter med svær lungebetændelse og reducere forekomsten af ​​bakteriel resistens.

Der er tre traditionelle metoder til påvisning af patogene mikroorganismer: 1. Mikrobiel dyrkningsmetode er det mest traditionelle middel til at identificere patogen. Det er nødvendigt at inokulere patientens kropsvæske, blod osv. i et passende medium, inkubere i en passende inkubator og derefter sende lægemidlet. Følsomhedstests bestemmer mikroorganismers resistens, tager normalt 3-7 dage. For nogle specifikke typer af patogene mikroorganismer eller mikroorganismer med barske vækstbetingelser kan der være negative dyrkningsresultater. Derfor har de traditionelle dyrkningsmetoder ulemper som dårlig aktualitet, relativt høje krav og lav positiv dyrkningsrate (30-40%). 2. time-of-flight massespektrometri: massespektrometri-teknikken bruges til at analysere og detektere stammens proteinkomponenter, og det karakteristiske topspektrum opnås. Sammenlignet med bakteriekortet i databasen kan bakterierne bedømmes ved matchning. Metoden kan forkortes med ca. 6-8 timer sammenlignet med den konventionelle dyrkningsmetode, men da påvisningen af ​​kolonien skal nå en vis mængde, kan prøven ikke påvises direkte efter prøvetagning, og den foreløbige mikrobielle kultur er påkrævet. Derfor tager detektionstiden stadig 1-2 dage eller mere, og der er også ulempen ved lav aktualitet. Derudover er det nødvendigt at sammenligne udvidelsen og standardiseringen af ​​databasen, og manglende evne til at analysere modstanden af ​​mikroorganismer er også utilstrækkeligheden af ​​detektionsteknologien. 3. High-throughput sekventeringsteknologi: Med den hurtige udvikling af molekylærbiologi i de senere år er high-throughput sekventeringsteknologi meget brugt i den tidlige diagnose af klinisk mikrobiologi, princippet er hovedsageligt gennem tilslutningen af ​​den universelle linker til fragmenteringen til blive sekvenseret. Genomisk DNA, som producerer titusinder af enkeltmolekyle polyklonale polymerasekædereaktionsarrays, udfører derefter storskala primerhybridisering og enzymforlængelse reaktioner og opnår fuldstændig DNA-sekvensinformation ved computeranalyse. Men denne teknologi er vanskeligt effektivt at skelne mellem patogene bakterier og baggrundsbakterier, teknologi og database skal standardiseres, detektionstiden tager stadig omkring 2 dage, kan ikke opnå mikrobiel resistens, dyre og andre mangler På kontoret. Sammenfattende stoppes den nuværende tidsfrist for målrettet anti-infektionsbehandling 2 dage efter prøvetagningen. Derfor er søgningen efter ny, patogen mikrobiel detektionsteknologi, der er hurtigere, mere præcis og mere følsom, et hotspot og et vanskeligt punkt inden for mikrobiel og anti-infektionsforskning i de senere år.

PCR-CRISPR/Cas12a-kombinationsteknologien af ​​alveolær skyllevæske udviklet af College of Life Sciences ved Nanjing University er baseret på PCR-amplifikation og fluorescenssignaldetektion to gange for at opnå påvisning af tilstedeværelsen og fraværet af specifikke DNA-sekvenser i testprøven. teknologi. Bestemmelsen af ​​detektionsresultatet af det kliniske prøvepatogen er baseret på sammenligningen af ​​fluorescensresultaterne af PCR-produktet af DNAD-prøven med fluorescensdetektionsresultaterne for den positive kontrol (PC) og den negative kontrol (NC) som standard . Den specifikke genkendelsesfunktion af CRISPR/Cas12a-systemet er afhængig af den specifikke vejledning og binding af crRNA'et til specifikt DNA, og specificiteten af ​​crRNA'et bestemmes ved påvisning af en positiv kontrol af et fælles patogen af ​​et enkelt crRNA. Detektionsteknologien er meget specifik og tager kun 2-3 timer, hvilket er et kvalitativt spring i detektionstiden sammenlignet med den konventionelle teknologi.

For at verificere gennemførligheden og nøjagtigheden af ​​teknologien, centret og Nanjing University of Life Sciences for de almindelige patogener af ICU-lungebetændelse (Acinetobacter baumannii, MRSA, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, etc.) for alveolær A foreløbig undersøgelse af PCR-CRISPR/Cas12a kombineret detektionsteknik til skyllevæske. Niogtyve prøver af alveolær skyllevæske i nedre luftveje blev dyrket ved konventionel bakteriekulturmetode og kombineret med PCR-CRISPR/Cas12a. Resultaterne viste, at nøjagtigheden af ​​påvisning og identifikation af patogener baseret på PCR-Cas12a-teknologi nåede 93,10% (27/29). For de 27 prøver kan patogenerne, der er inficeret med den traditionelle isolationskulturmetode, påvises med PCR-CRISPR/Cas12a-teknologi. De to undtagelser var påvisningen af ​​Acinetobacter baumannii i prøve nr. 6 ved den traditionelle isolationskulturmetode og påvisning af Proteus mirabilis i prøve nr. 13 (ikke inden for rækkevidden af ​​påviste patogener). Desuden var patogenerne identificeret ved PCR-CRISPR/Cas12a-kombinationsteknikken mere end en eller to forskellige fra de traditionelle dyrkningsmetoder, hvilket var i overensstemmelse med PCR, hvilket tyder på, at følsomheden er meget højere end for konventionel mikrobiel kultur, og resultaterne er pålidelige. Disse foreløbige resultater indikerer, at PCR-CRISPR/Cas12a kombineret detektionsteknik har god nøjagtighed og høj følsomhed.

Baseret på disse spekulerede forskerholdet i, at kombinationen af ​​PCR og CRISPR/Cas12a-detektionsteknologi af alveolær skyllevæske til at vejlede anti-infektiøs behandling af lungebetændelsespatienter kan opnå målrettet anti-infektiøs behandling og forbedre patientprognosen. For at validere ovenstående hypotese designet vi et multicenter randomiseret prospektivt studie, der sammenlignede virkningerne af PCR-CRISPR/Cas12a kombineret detektion med alveolær skyllevæske og traditionelle mikrobielle detektionsteknikker på antimikrobiel justering og prognose hos patienter med ICU-lungebetændelse. Det sigter mod at finde hurtigere, præcis og følsom mikrobiel detektionsteknologi til patienter med lungebetændelse og at opnå tidligere præcisionsbehandling.