Efeito de PCR-CRISPR/Cas12a nos esquemas anti-infecciosos precoces em pacientes com pneumonia ao ar livre

Pacientes internados em UTI apresentam alta incidência de infecção bacteriana no trato respiratório inferior, principalmente com pneumonia grave, muitas vezes causando sepse grave e choque séptico, que é uma das principais causas de morte nos pacientes. Atualmente, a maior dificuldade enfrentada pelos clínicos é o aumento contínuo da taxa de resistência bacteriana e o aumento da mortalidade dos pacientes devido à inadequação precoce do tratamento anti-infeccioso empírico. Estudos demonstraram que pacientes com PAV (Pneumonia Associada ao Ventilador) apresentam uso irracional de medicamentos na fase inicial, com taxa de mortalidade superior a 50%. Quando a taxa de uso de medicamentos apropriados caiu para 33%, enquanto o tempo de ventilação mecânica e o tempo de internação na UTI foram significativamente reduzidos. Portanto, identificar os patógenos o mais precocemente possível e encurtar o tempo de tratamento anti-infeccioso empírico são muito importantes para melhorar o prognóstico de pacientes com pneumonia grave e reduzir a incidência de resistência bacteriana.

Existem três métodos tradicionais para a detecção de microrganismos patogênicos: 1. O método de cultura microbiana é o meio mais tradicional de identificação de patógenos. É necessário inocular o fluido corporal do paciente, sangue, etc. em um meio adequado, incubar em uma incubadora adequada e depois passar o medicamento. Os testes de sensibilidade determinam a resistência dos microorganismos, geralmente levam de 3 a 7 dias. Para alguns tipos específicos de microorganismos patogênicos ou microorganismos com condições adversas de crescimento, pode haver resultados de cultura negativos. Portanto, os métodos tradicionais de cultura têm desvantagens, como falta de oportunidade, requisitos relativamente altos e baixa taxa de cultura positiva (30-40%). 2. Espectrometria de massa de tempo de voo: a técnica de espectrometria de massa é usada para analisar e detectar os componentes proteicos da cepa, e o espectro de pico característico é obtido. Comparado com o mapa bacteriano no banco de dados, as bactérias podem ser julgadas por correspondência. O método pode ser reduzido em cerca de 6-8 horas em comparação com o método de cultura convencional, mas como a detecção da colônia precisa atingir uma certa quantidade, a amostra não pode ser detectada diretamente após a obtenção da amostra e a cultura microbiana preliminar é requeridos. Portanto, o tempo de detecção ainda leva de 1 a 2 dias ou mais, e também há a desvantagem de baixa pontualidade. Além disso, é necessário comparar a expansão e padronização do banco de dados, e a impossibilidade de analisar a resistência dos microorganismos é também a inadequação da tecnologia de detecção. 3. Tecnologia de sequenciamento de alto rendimento: Com o rápido desenvolvimento da biologia molecular nos últimos anos, a tecnologia de sequenciamento de alto rendimento é amplamente utilizada no diagnóstico precoce da microbiologia clínica, o princípio é principalmente através da conexão do ligante universal à fragmentação para ser sequenciado. O DNA genômico, que produz dezenas de milhões de matrizes de reação em cadeia da polimerase policlonal de molécula única, realiza a hibridização de iniciadores em larga escala e reações de extensão enzimática e obtém informações completas da sequência de DNA por análise de computador. No entanto, esta tecnologia é difícil de distinguir efetivamente entre bactérias patogênicas e bactérias de fundo, tecnologia e banco de dados a serem padronizados, o tempo de detecção ainda leva cerca de 2 dias, não pode obter resistência microbiana, caro e outras deficiências no escritório. Em resumo, o limite de tempo atual para o tratamento anti-infeccioso direcionado é interrompido 2 dias após a coleta da amostra. Portanto, a busca por uma nova tecnologia de detecção microbiana patogênica que seja mais rápida, mais precisa e mais sensível é um ponto crítico e um ponto difícil no campo da pesquisa microbiana e anti-infecciosa nos últimos anos.

A tecnologia de combinação PCR-CRISPR/Cas12a de fluido de lavagem alveolar desenvolvida pela Faculdade de Ciências da Vida da Universidade de Nanjing é baseada na amplificação de PCR e detecção de sinal de fluorescência duas vezes para conseguir a detecção da presença e ausência de sequências específicas de DNA na amostra de teste. tecnologia. A determinação do resultado da detecção do patógeno da amostra clínica é baseada na comparação dos resultados de fluorescência do produto de PCR da amostra DNAD com os resultados da detecção de fluorescência do controle positivo (PC) e do controle negativo (NC) como padrão . A função de reconhecimento específico do sistema CRISPR/Cas12a depende da orientação específica e da ligação do crRNA ao DNA específico, e a especificidade do crRNA é determinada pela detecção de um controle positivo de um patógeno comum por um único crRNA. A tecnologia de detecção é altamente específica e leva apenas 2-3 horas, o que é um salto qualitativo no tempo de detecção em comparação com a tecnologia convencional.

A fim de verificar a viabilidade e precisão da tecnologia, o Centro e a Universidade de Ciências da Vida de Nanjing para os patógenos comuns da pneumonia na UTI (Acinetobacter baumannii, MRSA, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, etc.) para alveolar Um estudo preliminar do PCR-CRISPR/Cas12a técnica de detecção combinada para fluido de lavagem. Vinte e nove amostras de fluido de lavagem alveolar do trato respiratório inferior foram cultivadas pelo método convencional de cultura bacteriana e combinadas com PCR-CRISPR/Cas12a. Os resultados mostraram que a precisão de detecção e identificação de patógenos com base na tecnologia PCR-Cas12a atingiu 93,10% (27/29). Para as 27 amostras, os patógenos infectados pelo método tradicional de cultura de isolamento podem ser detectados pela tecnologia PCR-CRISPR/Cas12a. As duas exceções foram a detecção de Acinetobacter baumannii na amostra nº 6 pelo método tradicional de cultura de isolamento e a detecção de Proteus mirabilis na amostra nº 13 (fora da faixa de patógenos detectados). Além disso, os patógenos identificados pela técnica de combinação PCR-CRISPR/Cas12a foram mais de um ou dois diferentes dos métodos tradicionais de cultura, o que foi consistente com a PCR, sugerindo que a sensibilidade é muito maior do que a da cultura microbiana convencional, e o resultados são confiáveis. Esses resultados preliminares indicam que a técnica de detecção combinada PCR-CRISPR/Cas12a tem boa precisão e alta sensibilidade.

Com base nisso, a equipe de pesquisa especulou que a combinação de PCR e tecnologia de detecção CRISPR/Cas12a de fluido de lavagem alveolar para orientar o tratamento anti-infeccioso de pacientes com pneumonia pode alcançar o tratamento anti-infeccioso direcionado e melhorar o prognóstico do paciente. Para validar a hipótese acima, projetamos um estudo prospectivo randomizado multicêntrico comparando os efeitos da detecção combinada de PCR-CRISPR/Cas12a com fluido de lavagem alveolar e técnicas tradicionais de detecção microbiana no ajuste antimicrobiano e prognóstico em pacientes com pneumonia na UTI. O objetivo é encontrar uma tecnologia de detecção microbiana mais rápida, precisa e sensível para pacientes com pneumonia e obter um tratamento de precisão mais precoce.