野外肺炎患者の早期抗感染スキームに対する PCR-CRISPR/Cas12a の効果

ICU患者は、主に重度の肺炎を伴う下気道の細菌感染の発生率が高く、しばしば重度の敗血症および敗血症性ショックを引き起こし、患者の主な死因の1つです。 現在、臨床医が直面している最大の困難は、初期の不適切な経験的抗感染症治療による細菌耐性率の継続的な増加と患者の死亡率の増加です。 調査によると、VAP（人工呼吸器関連肺炎）の患者は初期段階で不合理な薬物使用をしており、死亡率は 50% を超えています。 適切な薬剤使用率が 33% に低下し、機械換気時間と ICU 入院時間が大幅に短縮された場合。 したがって、病原体をできるだけ早く特定し、経験的抗感染症治療の時間を短縮することは、重度の肺炎患者の予後を改善し、細菌耐性の発生率を減らすために非常に重要です。

病原性微生物を検出するための 3 つの伝統的な方法があります。 1. 微生物培養法は、病原体を識別する最も伝統的な手段です。 患者の体液、血液などを適切な培地に接種し、適切な培養器で培養した後、薬剤を通過させる必要があります。 感度試験は、微生物の耐性を判断するもので、通常 3 ～ 7 日かかります。 特定の種類の病原性微生物または生育条件が厳しい微生物については、培養結果が陰性になる場合があります。 したがって、従来の培養方法には、適時性が低い、比較的要求が高い、陽性培養率が低い (30 ～ 40%) などの欠点があります。 2.飛行時間質量分析：質量分析技術を使用して、株のタンパク質成分を分析および検出し、特徴的なピークスペクトルを取得します。 データベース内の細菌マップと比較し、マッチングにより細菌を判定できます。 従来の培養法に比べて約6～8時間短縮できるが、コロニーの検出には一定量が必要なため、検体採取後に直接検体を検出することができず、微生物の予備培養が必要となる。必要。 そのため、発見までにはまだ1～2日以上かかり、適時性が低いというデメリットもあります。 また、データベースの拡充と標準化を比較検討する必要があり、微生物の耐性解析ができないのも検出技術の不備です。 3. ハイスループットシーケンシング技術: 近年の分子生物学の急速な発展に伴い、ハイスループットシーケンシング技術は臨床微生物学の早期診断に広く使用されており、その原理は主にユニバーサルリンカーの断片化への接続によるものです。配列されます。 何千万もの単一分子ポリクローナル ポリメラーゼ連鎖反応アレイを生成するゲノム DNA は、その後、大規模なプライマー ハイブリダイゼーションと酵素伸長反応を実行し、コンピューター解析によって完全な DNA 配列情報を取得します。 しかし、この技術は病原菌と背景菌を効果的に区別することは難しく、技術とデータベースは標準化され、検出時間はまだ約2日かかり、微生物耐性を得ることができず、高価であるなどの欠点がありました。 要約すると、ターゲットを絞った抗感染症治療の現在の制限時間は、標本が採取されてから 2 日後に停止されます。 したがって、より速く、より正確で、より感度の高い新しい病原性微生物検出技術の探索は、近年の微生物および抗感染症研究の分野におけるホットスポットであり、困難な点です。

南京大学生命科学部によって開発された肺胞洗浄液の PCR-CRISPR/Cas12a 組み合わせ技術は、PCR 増幅と蛍光シグナル検出を 2 回使用して、テスト サンプル中の特定の DNA 配列の有無を検出します。 テクノロジー。 臨床サンプル病原体の検出結果の決定は、サンプル DNAD の PCR 産物の蛍光結果と、ポジティブ コントロール (PC) およびネガティブ コントロール (NC) の蛍光検出結果を基準として比較することに基づいています。 . CRISPR/Cas12a システムの特定の認識機能は、crRNA の特定のガイダンスと特定の DNA への結合に依存しており、crRNA の特異性は、単一の crRNA による一般的な病原体のポジティブ コントロールの検出によって決定されます。 この検出技術は非常に特異的で、わずか 2 ～ 3 時間で済みます。これは、従来の技術と比較して検出時間の質的な飛躍です。

技術の実現可能性と精度を検証するために、センターと南京生命科学大学は、ICU 肺炎の一般的な病原体 (Acinetobacter baumannii、MRSA、Klebsiella pneumoniae、Pseudomonas aeruginosa など) について肺胞の予備研究を行いました。洗浄液のPCR-CRISPR/Cas12a複合検出技術。 下気道肺胞洗浄液の 29 検体を従来の細菌培養法で培養し、PCR-CRISPR/Cas12a と組み合わせました。 結果は、PCR-Cas12a 技術に基づく病原体の検出と同定の精度が 93.10% (27/29) に達したことを示しました。 27 検体について、従来の分離培養法で感染した病原体を PCR-CRISPR/Cas12a 技術で検出できます。 2 つの例外は、従来の分離培養法による 6 号検体での Acinetobacter baumannii の検出と、13 号検体での Proteus mirabilis の検出（検出された病原体の範囲外）でした。 さらに、PCR-CRISPR/Cas12a の組み合わせ技術によって同定された病原体は、従来の培養方法とは 1 つまたは 2 つ以上異なっており、PCR と一致しており、従来の微生物培養よりも感度がはるかに高いことを示唆しています。結果は信頼できます。 これらの予備的な結果は、PCR-CRISPR/Cas12a を組み合わせた検出技術の精度と感度が高いことを示しています。

それらに基づいて、研究チームは、肺胞洗浄液の PCR と CRISPR/Cas12a 検出技術を組み合わせて、肺炎患者の抗感染治療を導くことで、標的を定めた抗感染治療を達成し、患者の予後を改善できると推測しました。 上記の仮説を検証するために、ICU 肺炎患者の抗菌調整と予後に対する肺胞洗浄液と従来の微生物検出技術を組み合わせた PCR-CRISPR/Cas12a 検出の効果を比較する多施設ランダム化前向き研究を設計しました。 肺炎患者のより迅速で正確かつ高感度な微生物検出技術を発見し、より早期の精密治療を実現することを目的としています。