Влияние PCR-CRISPR/Cas12a на ранние противоинфекционные схемы у пациентов с открытой пневмонией

У пациентов ОИТ высока частота бактериальной инфекции нижних дыхательных путей, в основном с тяжелой пневмонией, часто вызывающей тяжелый сепсис и септический шок, что является одной из основных причин смерти пациентов. В настоящее время самой большой трудностью, с которой сталкиваются клиницисты, является непрерывный рост уровня бактериальной резистентности и увеличение смертности пациентов из-за ранней неадекватности эмпирического противоинфекционного лечения. Исследования показали, что пациенты с ВАП (вентилятор-ассоциированная пневмония) имеют нерациональное употребление наркотиков на ранней стадии, при этом уровень смертности превышает 50%. Когда уровень адекватного употребления наркотиков снизился до 33%, а время ИВЛ и время госпитализации в ОИТ значительно сократились. Поэтому как можно более раннее выявление возбудителей и сокращение сроков эмпирического противоинфекционного лечения очень важны для улучшения прогноза больных тяжелой пневмонией и снижения частоты бактериальной резистентности.

Существует три традиционных метода обнаружения патогенных микроорганизмов: 1. Метод микробной культуры является наиболее традиционным средством идентификации возбудителя. Необходимо засеять биологические жидкости больного, кровь и т. д. в подходящую среду, инкубировать в подходящем инкубаторе, а затем ввести препарат. Тесты на чувствительность, определяющие резистентность микроорганизмов, обычно занимают 3-7 дней. Для некоторых конкретных типов патогенных микроорганизмов или микроорганизмов с суровыми условиями роста могут быть отрицательные результаты посева. Таким образом, традиционные методы культивирования имеют такие недостатки, как плохая своевременность, относительно высокие требования и низкий процент положительных результатов культивирования (30-40%). 2. времяпролетная масс-спектрометрия: метод масс-спектрометрии используется для анализа и обнаружения белковых компонентов штамма и получения характеристического спектра пиков. По сопоставлению с бактериальной картой в базе данных можно судить о бактериях. Этот метод может быть сокращен примерно на 6-8 часов по сравнению с обычным методом культивирования, но, поскольку для обнаружения колонии необходимо достичь определенного количества, образец не может быть непосредственно обнаружен после получения образца, и предварительная микробная культура обязательный. Поэтому время обнаружения по-прежнему занимает 1-2 дня и более, а недостаток - низкая своевременность. Кроме того, необходимо сопоставлять расширение и стандартизацию базы данных, а невозможность анализа устойчивости микроорганизмов также является неадекватностью технологии обнаружения. 3. Технология высокопроизводительного секвенирования: с быстрым развитием молекулярной биологии в последние годы технология высокопроизводительного секвенирования широко используется в ранней диагностике клинической микробиологии, принцип в основном заключается в соединении универсального линкера с фрагментацией к быть упорядоченным. Геномная ДНК, которая производит десятки миллионов одномолекулярных поликлональных полимеразных цепных реакций, затем выполняет крупномасштабную гибридизацию праймеров и реакции удлинения фермента, а также получает полную информацию о последовательности ДНК с помощью компьютерного анализа. Однако с помощью этой технологии трудно эффективно различать патогенные бактерии и фоновые бактерии, технология и база данных должны быть стандартизированы, время обнаружения по-прежнему занимает около 2 дней, невозможно получить устойчивость к микробам, дороговизна и другие недостатки. В офисе. Таким образом, текущий срок для целевого противоинфекционного лечения прекращается через 2 дня после взятия образца. Таким образом, поиск новых, более быстрых, точных и чувствительных технологий обнаружения патогенных микробов является актуальным и трудным моментом в области микробных и противоинфекционных исследований в последние годы.

Комбинированная технология ПЦР-CRISPR/Cas12a жидкости альвеолярного лаважа, разработанная Колледжем наук о жизни Нанкинского университета, основана на амплификации ПЦР и обнаружении флуоресцентного сигнала дважды для достижения обнаружения присутствия и отсутствия определенных последовательностей ДНК в тестируемом образце. технологии. Определение результата детекции клинического образца возбудителя основано на сравнении результатов флуоресценции продукта ПЦР образца ДНКД с результатами детекции флуоресценции положительного контроля (ПК) и отрицательного контроля (НК) в качестве эталона. . Специфическая функция распознавания системы CRISPR/Cas12a основана на специфическом направлении и связывании crРНК со специфической ДНК, а специфичность crРНК определяется обнаружением положительного контроля распространенного патогена с помощью одной crРНК. Технология обнаружения очень специфична и занимает всего 2-3 часа, что является качественным скачком во времени обнаружения по сравнению с традиционной технологией.

С целью проверки осуществимости и точности технологии, Центр и Нанкинский университет наук о жизни для распространенных возбудителей пневмонии ОИТ (Acinetobacter baumannii, MRSA, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa и др.) для альвеолярного Комбинированный метод обнаружения ПЦР-CRISPR/Cas12a для лаважной жидкости. Двадцать девять образцов жидкости альвеолярного лаважа нижних дыхательных путей были культивированы традиционным методом бактериального культивирования и объединены с ПЦР-CRISPR/Cas12a. Результаты показали, что точность обнаружения и идентификации возбудителей на основе технологии ПЦР-Cas12a достигла 93,10% (27/29). В 27 образцах патогены, инфицированные традиционным методом выделения культур, могут быть обнаружены с помощью технологии ПЦР-CRISPR/Cas12a. Двумя исключениями были обнаружение Acinetobacter baumannii в образце № 6 с помощью традиционного метода выделения культур и обнаружение Proteus mirabilis в образце № 13 (не в пределах диапазона обнаруженных патогенов). Более того, патогены, идентифицированные с помощью комбинированного метода ПЦР-CRISPR/Cas12a, более чем на один или два раза отличались от традиционных методов культивирования, что согласуется с ПЦР, предполагая, что чувствительность намного выше, чем у обычного микробного культивирования, и результаты надежны. Эти предварительные результаты показывают, что комбинированный метод обнаружения PCR-CRISPR/Cas12a обладает хорошей точностью и высокой чувствительностью.

Основываясь на этом, исследовательская группа предположила, что сочетание ПЦР и технологии обнаружения CRISPR/Cas12a в жидкости альвеолярного лаважа для проведения противоинфекционного лечения пациентов с пневмонией может обеспечить целенаправленное противоинфекционное лечение и улучшить прогноз пациента. Чтобы подтвердить вышеизложенную гипотезу, мы разработали многоцентровое рандомизированное проспективное исследование, сравнивающее влияние комбинированного обнаружения ПЦР-CRISPR/Cas12a с альвеолярным лаважем и традиционных методов обнаружения микробов на антимикробную коррекцию и прогноз у пациентов с пневмонией в отделении интенсивной терапии. Он направлен на поиск более быстрой, точной и чувствительной технологии обнаружения микробов у пациентов с пневмонией, а также на более раннее точное лечение.