Wpływ PCR-CRISPR/Cas12a na wczesne schematy przeciwinfekcyjne u pacjentów z zapaleniem płuc na otwartym powietrzu

U pacjentów OIOM występuje duża częstość zakażeń bakteryjnych dolnych dróg oddechowych, głównie z ciężkim zapaleniem płuc, często powodujących ciężką posocznicę i wstrząs septyczny, co jest jedną z głównych przyczyn zgonów pacjentów. Obecnie największą trudnością, z jaką borykają się klinicyści, jest ciągły wzrost oporności bakterii oraz wzrost śmiertelności pacjentów z uwagi na wczesną nieadekwatność empirycznego leczenia przeciwinfekcyjnego. Badania wykazały, że pacjenci z VAP (zapalenie płuc związane z respiratorem) mają nieracjonalne zażywanie narkotyków we wczesnym stadium, ze śmiertelnością przekraczającą 50%. Kiedy wskaźnik prawidłowego zażywania narkotyków spadł do 33%, a czas wentylacji mechanicznej i czas hospitalizacji na OIT uległy znacznemu skróceniu. Dlatego też jak najwcześniejsza identyfikacja patogenów i skrócenie czasu empirycznego leczenia przeciwinfekcyjnego są bardzo ważne dla poprawy rokowania pacjentów z ciężkim zapaleniem płuc i zmniejszenia częstości występowania oporności bakterii.

Istnieją trzy tradycyjne metody wykrywania drobnoustrojów chorobotwórczych: 1. Metoda hodowli drobnoustrojów jest najbardziej tradycyjnym sposobem identyfikacji patogenu. Konieczne jest zaszczepienie płynu ustrojowego pacjenta, krwi itp. w odpowiednim podłożu, inkubacja w odpowiednim inkubatorze, a następnie podanie leku. Testy wrażliwości określają odporność mikroorganizmów, zwykle trwa 3-7 dni. W przypadku niektórych określonych typów mikroorganizmów chorobotwórczych lub mikroorganizmów żyjących w trudnych warunkach wzrostu wyniki posiewów mogą być ujemne. Dlatego tradycyjne metody hodowli mają wady, takie jak mała terminowość, stosunkowo wysokie wymagania i niski wskaźnik dodatnich kultur (30-40%). 2. spektrometria masowa czasu przelotu: technikę spektrometrii mas stosuje się do analizy i wykrywania składników białkowych szczepu oraz uzyskiwania charakterystycznego widma pików. W porównaniu z mapą bakterii w bazie danych, bakterie można ocenić poprzez dopasowanie. Metodę można skrócić o około 6-8 godzin w porównaniu z konwencjonalną metodą hodowli, ale ponieważ wykrycie kolonii musi osiągnąć określoną ilość, próbki nie można wykryć bezpośrednio po jej uzyskaniu, a wstępna kultura drobnoustrojów jest wymagany. Dlatego czas wykrywania nadal trwa 1-2 dni lub dłużej, a wadą jest również niska terminowość. Ponadto konieczne jest porównanie rozbudowy i standaryzacji bazy danych, a brak możliwości analizy odporności mikroorganizmów to także nieadekwatność technologii detekcji. 3. Technologia sekwencjonowania o wysokiej przepustowości: wraz z szybkim rozwojem biologii molekularnej w ostatnich latach, technologia sekwencjonowania o wysokiej przepustowości jest szeroko stosowana we wczesnej diagnostyce mikrobiologii klinicznej, zasada polega głównie na połączeniu uniwersalnego łącznika z fragmentacją do być zsekwencjonowane. Genomowy DNA, który wytwarza dziesiątki milionów jednocząsteczkowych macierzy reakcji łańcuchowej polimerazy poliklonalnej, następnie przeprowadza hybrydyzację starterów na dużą skalę i reakcje wydłużania enzymów oraz uzyskuje pełne informacje o sekwencji DNA za pomocą analizy komputerowej. Jednak ta technologia jest trudna do skutecznego rozróżnienia między bakteriami chorobotwórczymi a bakteriami tła, technologia i baza danych do standaryzacji, czas wykrywania nadal trwa około 2 dni, nie można uzyskać odporności drobnoustrojów, drogie i inne niedociągnięcia w biurze. Podsumowując, obecny limit czasowy ukierunkowanego leczenia przeciwinfekcyjnego upływa 2 dni po pobraniu próbki. Dlatego poszukiwanie nowej, szybszej, dokładniejszej i bardziej czułej technologii wykrywania drobnoustrojów chorobotwórczych jest gorącym punktem i trudnym punktem w dziedzinie badań mikrobiologicznych i przeciwinfekcyjnych w ostatnich latach.

Technologia łączenia PCR-CRISPR/Cas12a płynu do płukania pęcherzyków płucnych opracowana przez Kolegium Nauk Przyrodniczych Uniwersytetu Nanjing opiera się na dwukrotnej amplifikacji PCR i wykrywaniu sygnału fluorescencyjnego w celu wykrycia obecności i braku określonych sekwencji DNA w badanej próbce. technologia. Określenie wyniku detekcji patogenu próbki klinicznej opiera się na porównaniu wyników fluorescencji produktu PCR próbki DNAD z wynikami detekcji fluorescencji kontroli pozytywnej (PC) i kontroli negatywnej (NC) jako wzorca . Specyficzna funkcja rozpoznawania systemu CRISPR/Cas12a opiera się na specyficznym kierowaniu i wiązaniu crRNA ze specyficznym DNA, a specyficzność crRNA jest określana przez wykrycie kontroli pozytywnej wspólnego patogenu przez pojedynczy crRNA. Technologia wykrywania jest wysoce specyficzna i zajmuje tylko 2-3 godziny, co stanowi jakościowy skok w czasie wykrywania w porównaniu z konwencjonalną technologią.

W celu zweryfikowania wykonalności i dokładności technologii, Centrum i Uniwersytet Przyrodniczy w Nanjing dla powszechnych patogenów zapalenia płuc na OIT (Acinetobacter baumannii, MRSA, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa itp.) dla pęcherzyków płucnych Wstępne badanie PCR-CRISPR/Cas12a połączona technika wykrywania płynu popłucznego. Dwadzieścia dziewięć próbek płynu z popłuczyn dolnych dróg oddechowych wyhodowano konwencjonalną metodą hodowli bakteryjnej i połączono z PCR-CRISPR/Cas12a. Wyniki pokazały, że dokładność wykrywania i identyfikacji patogenów w oparciu o technologię PCR-Cas12a osiągnęła poziom 93,10% (27/29). W przypadku 27 próbek patogeny zakażone tradycyjną metodą hodowli izolacyjnej można wykryć za pomocą technologii PCR-CRISPR/Cas12a. Dwa wyjątki to wykrycie Acinetobacter baumannii w próbce nr 6 tradycyjną metodą hodowli izolacyjnej oraz wykrycie Proteus mirabilis w próbce nr 13 (poza zakresem wykrywanych patogenów). Co więcej, patogeny zidentyfikowane techniką łączoną PCR-CRISPR/Cas12a różniły się więcej niż jedną lub dwiema metodami od tradycyjnych metod hodowli, co było zgodne z metodą PCR, co sugeruje, że czułość jest znacznie wyższa niż w przypadku konwencjonalnej hodowli drobnoustrojów, a wyniki są wiarygodne. Te wstępne wyniki wskazują, że łączona technika wykrywania PCR-CRISPR/Cas12a ma dobrą dokładność i wysoką czułość.

Na tej podstawie zespół badawczy spekulował, że połączenie technologii wykrywania PCR i CRISPR/Cas12a płynu z płukania pęcherzyków płucnych w celu kierowania leczeniem przeciwinfekcyjnym pacjentów z zapaleniem płuc może zapewnić ukierunkowane leczenie przeciwinfekcyjne i poprawić rokowania pacjentów. Aby zweryfikować powyższą hipotezę, zaprojektowaliśmy wieloośrodkowe, randomizowane, prospektywne badanie porównujące wpływ połączonego wykrywania PCR-CRISPR / Cas12a z płynem z płukania pęcherzyków płucnych i tradycyjnymi technikami wykrywania drobnoustrojów na dostosowanie środków przeciwdrobnoustrojowych i rokowanie u pacjentów z zapaleniem płuc na OIT. Jego celem jest znalezienie szybszej, dokładniejszej i bardziej czułej technologii wykrywania drobnoustrojów u pacjentów z zapaleniem płuc oraz osiągnięcie wcześniejszej precyzji leczenia.