A PCR-CRISPR/Cas12a hatása a korai fertőzésellenes sémákra szabadtéri tüdőgyulladásban szenvedő betegeknél

Az intenzív osztályos betegeknél magas az alsó légúti bakteriális fertőzések előfordulása, főként súlyos tüdőgyulladással, gyakran súlyos szepszist és szeptikus sokkot okozva, ami a betegek egyik fő haláloka. A klinikusok számára jelenleg a legnagyobb nehézséget a bakteriális rezisztencia arányának folyamatos növekedése és a betegek halálozási arányának növekedése jelenti a korai elégtelen empirikus fertőzésellenes kezelés miatt. Tanulmányok kimutatták, hogy a VAP-ban (Ventilator Associated Pneumonia) szenvedő betegek irracionálisan használnak kábítószert korai stádiumban, és a halálozási arány több mint 50%. Amikor a megfelelő szerhasználat aránya 33%-ra csökkent, miközben a gépi lélegeztetés és az intenzív osztályos kórházi kezelés ideje jelentősen lerövidült. Ezért a kórokozók mielőbbi azonosítása és az empirikus fertőzésellenes kezelés idejének lerövidítése nagyon fontos a súlyos tüdőgyulladásban szenvedő betegek prognózisának javítása és a bakteriális rezisztencia előfordulásának csökkentése szempontjából.

Három hagyományos módszer létezik a kórokozó mikroorganizmusok kimutatására: 1. A mikrobiális tenyésztés módszere a kórokozó azonosításának leghagyományosabb módja. Szükséges a beteg testnedvének, vérének stb. megfelelő tápközegben történő beoltása, megfelelő inkubátorban történő inkubálása, majd a gyógyszer átadása. Az érzékenységi tesztek meghatározzák a mikroorganizmusok rezisztenciáját, általában 3-7 napig tartanak. A kórokozó mikroorganizmusok bizonyos típusai vagy a zord növekedési körülmények között élő mikroorganizmusok esetében negatív tenyésztési eredmények adódhatnak. Ezért a hagyományos tenyésztési módszereknek olyan hátrányai vannak, mint a rossz időszerűség, a viszonylag magas követelmények és az alacsony pozitív tenyésztési arány (30-40%). 2. repülési idő tömegspektrometria: a tömegspektrometriás technikát alkalmazzuk a törzs fehérjekomponenseinek elemzésére és kimutatására, és megkapjuk a jellegzetes csúcsspektrumot. Összehasonlítva az adatbázisban található baktériumtérképpel, a baktériumokat egyezés alapján lehet megítélni. A módszer körülbelül 6-8 órával lerövidíthető a hagyományos tenyésztési módszerhez képest, de mivel a telep kimutatásának el kell érnie egy bizonyos mennyiséget, a minta a mintavétel után közvetlenül nem detektálható, és az előzetes mikrobiális tenyésztés kívánt. Ezért az észlelési idő még mindig 1-2 napig vagy még tovább tart, és hátránya az alacsony időszerűség is. Emellett össze kell hasonlítani az adatbázis bővítését és szabványosítását, és a mikroorganizmusok rezisztenciájának elemzésére való képtelenség is a kimutatási technológia elégtelensége. 3. Nagy áteresztőképességű szekvenálási technológia: A molekuláris biológia elmúlt évek gyors fejlődésével a nagy áteresztőképességű szekvenálási technológiát széles körben alkalmazzák a klinikai mikrobiológia korai diagnosztizálásában, az alapelv elsősorban az univerzális linker és a fragmentációhoz való kapcsolódása. sorrendbe kell állítani. A genomi DNS, amely több tízmillió egymolekulájú poliklonális polimeráz láncreakció tömböt állít elő, majd nagy léptékű primer hibridizációs és enzimextendációs reakciókat hajt végre, és számítógépes elemzéssel teljes DNS-szekvencia-információt kap. Azonban ezt a technológiát nehéz hatékonyan megkülönböztetni a patogén baktériumok és a háttérbaktériumok között, szabványosítani kell a technológiát és az adatbázist, az észlelési idő még mindig körülbelül 2 napig tart, nem lehet mikrobiális rezisztenciát szerezni, drága és egyéb hiányosságok Az irodában. Összefoglalva, a célzott fertőzésellenes kezelés jelenlegi határideje a mintavétel után 2 nappal leáll. Ezért az új, gyorsabb, pontosabb és érzékenyebb patogén mikrobiális kimutatási technológia felkutatása az elmúlt évek mikrobiális és fertőzésellenes kutatásának hotspotja és nehéz pontja.

A Nanjing Egyetem Élettudományi Kollégiuma által kifejlesztett alveoláris mosófolyadék PCR-CRISPR/Cas12a kombinációs technológiája a PCR-amplifikáción és a fluoreszcens jelek kétszeri detektálásán alapul, hogy elérje a specifikus DNS-szekvenciák jelenlétének és hiányának kimutatását a vizsgálati mintában. technológia. A klinikai minta kórokozójának kimutatási eredményének meghatározása a minta DNSD PCR terméke fluoreszcencia eredményeinek összehasonlításán alapul a pozitív kontroll (PC) és a negatív kontroll (NC) mint standard fluoreszcencia kimutatási eredményeivel. . A CRISPR/Cas12a rendszer specifikus felismerési funkciója a crRNS specifikus irányításán és specifikus DNS-hez való kötődésén alapul, a crRNS specificitását pedig egy közös kórokozó pozitív kontrolljának egyetlen crRNS-sel történő kimutatása határozza meg. Az észlelési technológia rendkívül specifikus és mindössze 2-3 órát vesz igénybe, ami minőségi ugrás az észlelési időben a hagyományos technológiához képest.

A technológia megvalósíthatóságának és pontosságának igazolása érdekében a Központ és a Nanjingi Élettudományi Egyetem az intenzív osztályos tüdőgyulladás gyakori kórokozóira (Acinetobacter baumannii, MRSA, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa stb.) az alveoláris A előzetes tanulmányozására. PCR-CRISPR/Cas12a kombinált kimutatási technika öblítőfolyadékhoz. Huszonkilenc alsó légúti alveoláris mosófolyadék mintát tenyésztettünk hagyományos baktériumtenyésztési módszerrel, és kombináltuk PCR-CRISPR/Cas12a-val. Az eredmények azt mutatták, hogy a PCR-Cas12a technológia alapján a kórokozók kimutatásának és azonosításának pontossága elérte a 93,10%-ot (27/29). A 27 minta esetében a hagyományos izolációs tenyésztési módszerrel fertőzött kórokozók PCR-CRISPR/Cas12a technológiával mutathatók ki. A két kivétel az Acinetobacter baumannii kimutatása a 6. számú mintában a hagyományos izolációs tenyésztési módszerrel és a Proteus mirabilis kimutatása a 13. számú mintában (nem a kimutatott kórokozók tartományán belül). Ezenkívül a PCR-CRISPR/Cas12a kombinációs technikával azonosított kórokozók egynél-kétszer különböztek a hagyományos tenyésztési módszerektől, ami összhangban volt a PCR-rel, ami arra utal, hogy az érzékenység sokkal nagyobb, mint a hagyományos mikrobiális tenyésztésé. az eredmények megbízhatóak. Ezek az előzetes eredmények azt mutatják, hogy a PCR-CRISPR/Cas12a kombinált detektálási technika jó pontossággal és nagy érzékenységgel rendelkezik.

Ezek alapján a kutatócsoport azt feltételezte, hogy az alveoláris öblítőfolyadék PCR és CRISPR/Cas12a kimutatási technológiájának kombinációja a tüdőgyulladásos betegek fertőzésellenes kezelésének iránymutatása érdekében célzott fertőzésellenes kezelést érhet el, és javíthatja a betegek prognózisát. A fenti hipotézis igazolására egy többközpontú, randomizált prospektív vizsgálatot terveztünk, amelyben a PCR-CRISPR/Cas12a kombinált kimutatás alveoláris mosófolyadékkal és a hagyományos mikrobiális kimutatási technikák hatásait hasonlították össze az ICU tüdőgyulladásban szenvedő betegek antimikrobiális beállítására és prognózisára. Célja a tüdőgyulladásban szenvedő betegek gyorsabb, pontosabb és érzékenyebb mikrobiális kimutatási technológiája, valamint a korábbi precíziós kezelés elérése.