Effekt av PCR-CRISPR/Cas12a på de tidlige anti-infeksjonsordningene hos pasienter med lungebetennelse i friluft

ICU-pasienter har høy forekomst av bakteriell infeksjon i nedre luftveier, hovedsakelig med alvorlig lungebetennelse, som ofte forårsaker alvorlig sepsis og septisk sjokk, som er en av de viktigste dødsårsakene hos pasienter. For tiden er den største vanskeligheten klinikere står overfor den kontinuerlige økningen av bakteriell resistensrate og økningen i pasientdødelighet på grunn av den tidlige utilstrekkelige empiriske anti-infeksjonsbehandlingen. Studier har vist at pasienter med VAP (Ventilator Associated Pneumonia) har irrasjonell medikamentbruk på et tidlig stadium, med en dødelighet på mer enn 50 %. Når frekvensen av passende medikamentbruk har sunket til 33 %, mens mekanisk ventilasjonstid og ICU-innleggelsestid har blitt betydelig forkortet. Derfor er det svært viktig å identifisere patogener så tidlig som mulig og forkorte tiden for empirisk anti-infeksjonsbehandling for å forbedre prognosen til pasienter med alvorlig lungebetennelse og redusere forekomsten av bakteriell resistens.

Det er tre tradisjonelle metoder for å oppdage patogene mikroorganismer: 1. Mikrobiell kulturmetode er den mest tradisjonelle metoden for å identifisere patogen. Det er nødvendig å inokulere pasientens kroppsvæske, blod osv. i et egnet medium, inkubere i en egnet inkubator, og deretter sende stoffet. Sensitivitetstester bestemmer motstanden til mikroorganismer, tar vanligvis 3-7 dager. For enkelte spesifikke typer patogene mikroorganismer eller mikroorganismer med tøffe vekstforhold kan det være negative dyrkingsresultater. Derfor har de tradisjonelle kulturmetodene ulemper som dårlig aktualitet, relativt høye krav og lav positiv kulturrate (30-40%). 2. time-of-flight massespektrometri: massespektrometriteknikken brukes til å analysere og detektere proteinkomponentene til stammen, og det karakteristiske toppspekteret oppnås. Sammenlignet med bakteriekartet i databasen, kan bakteriene bedømmes ved å matche. Metoden kan forkortes med ca. 6-8 timer sammenlignet med den konvensjonelle kulturmetoden, men siden deteksjonen av kolonien må nå en viss mengde, kan ikke prøven påvises direkte etter at prøven er tatt, og den foreløpige mikrobielle kulturen er nødvendig. Derfor tar deteksjonstiden fortsatt 1-2 dager eller mer, og det er også ulempen med lav aktualitet. I tillegg er det nødvendig å sammenligne utvidelsen og standardiseringen av databasen, og manglende evne til å analysere motstanden til mikroorganismer er også mangelen på deteksjonsteknologien. 3. High-throughput sekvenseringsteknologi: Med den raske utviklingen av molekylærbiologi de siste årene, er high-throughput sekvenseringsteknologi mye brukt i tidlig diagnose av klinisk mikrobiologi, prinsippet er hovedsakelig gjennom koblingen av den universelle linkeren til fragmenteringen til bli sekvensert. Genomisk DNA, som produserer titalls millioner av enkeltmolekylære polyklonale polymerasekjedereaksjoner, utfører deretter storskala primerhybridisering og enzymforlengelsesreaksjoner, og innhenter fullstendig DNA-sekvensinformasjon ved hjelp av dataanalyse. Imidlertid er denne teknologien vanskelig å effektivt skille mellom patogene bakterier og bakgrunnsbakterier, teknologi og database som skal standardiseres, deteksjonstiden tar fortsatt ca. 2 dager, kan ikke oppnå mikrobiell resistens, dyre og andre mangler På kontoret. Oppsummert stoppes gjeldende frist for målrettet anti-infeksjonsbehandling 2 dager etter at prøven er tatt. Derfor er jakten på ny, patogen mikrobiell deteksjonsteknologi som er raskere, mer nøyaktig og mer følsom et hotspot og et vanskelig punkt innen mikrobiell og anti-infeksjonsforskning de siste årene.

PCR-CRISPR/Cas12a-kombinasjonsteknologien av alveolær skyllevæske utviklet av College of Life Sciences ved Nanjing University er basert på PCR-amplifikasjon og fluorescenssignaldeteksjon to ganger for å oppnå påvisning av tilstedeværelse og fravær av spesifikke DNA-sekvenser i testprøven. teknologi. Bestemmelsen av deteksjonsresultatet for det kliniske prøvepatogenet er basert på sammenligningen av fluorescensresultatene til PCR-produktet fra prøve-DNAD med fluorescensdeteksjonsresultatene for den positive kontrollen (PC) og den negative kontrollen (NC) som standard. . Den spesifikke gjenkjenningsfunksjonen til CRISPR/Cas12a-systemet er avhengig av spesifikk veiledning og binding av crRNA til spesifikt DNA, og spesifisiteten til crRNA bestemmes ved påvisning av en positiv kontroll av et vanlig patogen av et enkelt crRNA. Deteksjonsteknologien er svært spesifikk og tar kun 2-3 timer, som er et kvalitativt sprang i deteksjonstiden sammenlignet med konvensjonell teknologi.

For å verifisere gjennomførbarheten og nøyaktigheten til teknologien, senteret og Nanjing University of Life Sciences for de vanlige patogenene til ICU-lungebetennelse (Acinetobacter baumannii, MRSA, Klebsiella pneumoniae, Pseudomonas aeruginosa, etc.) for alveolar A foreløpig studie av PCR-CRISPR/Cas12a kombinert deteksjonsteknikk for skyllevæske. 29 prøver av alveolær skyllevæske i nedre luftveier ble dyrket ved konvensjonell bakteriekulturmetode og kombinert med PCR-CRISPR/Cas12a. Resultatene viste at nøyaktigheten av deteksjon og identifisering av patogener basert på PCR-Cas12a-teknologi nådde 93,10 % (27/29). For de 27 prøvene kan patogenene infisert med den tradisjonelle isolasjonskulturmetoden påvises med PCR-CRISPR/Cas12a-teknologi. De to unntakene var påvisning av Acinetobacter baumannii i prøve nr. 6 ved den tradisjonelle isolasjonskulturmetoden og påvisning av Proteus mirabilis i prøve nr. 13 (ikke innenfor rekkevidden av påviste patogener). Dessuten var patogenene identifisert av PCR-CRISPR/Cas12a-kombinasjonsteknikken mer enn én eller to forskjellige fra de tradisjonelle kulturmetodene, som var i samsvar med PCR, noe som tyder på at sensitiviteten er mye høyere enn for konvensjonell mikrobiell kultur, og resultatene er pålitelige. Disse foreløpige resultatene indikerer at PCR-CRISPR/Cas12a kombinert deteksjonsteknikk har god nøyaktighet og høy følsomhet.

Basert på disse spekulerte forskerteamet i at kombinasjonen av PCR og CRISPR/Cas12a-deteksjonsteknologi av alveolær skyllevæske for å veilede anti-infeksiøs behandling av lungebetennelsespasienter kan oppnå målrettet anti-infeksiv behandling og forbedre pasientens prognose. For å validere hypotesen ovenfor, designet vi en multisenter randomisert prospektiv studie som sammenlignet effekten av PCR-CRISPR/Cas12a kombinert deteksjon med alveolar skyllevæske og tradisjonelle mikrobielle deteksjonsteknikker på antimikrobiell justering og prognose hos pasienter med ICU lungebetennelse. Målet er å finne raskere, nøyaktig og sensitiv mikrobiell deteksjonsteknologi for pasienter med lungebetennelse, og å oppnå tidligere presisjonsbehandling.