卵巢生殖细胞肿瘤中蛋白 P16 表达的免疫组织化学评价。

在这项研究中，我们的目标是：

1-评估 p16 在良性和恶性 OGCT 肿瘤成分中的免疫组织化学表达并对其免疫反应性进行评分。

2-MOGCT 中 P16 免疫组织化学表达与 Ki 67 增殖指数和 FIGO 分期之间的相关性。

1. 研究类型：匹配病例对照研究。

2. 学习科目：

   1. 纳入标准：不同类型的卵巢生殖细胞肿瘤包括：良性（成熟囊性畸胎瘤）和恶性（无性细胞瘤、未成熟畸胎瘤和卵黄囊瘤）。

   2. 排除标准：

      任何不满足纳入标准的标准，例如卵巢生殖细胞肿瘤以外的切除卵巢肿瘤，例如上皮性卵巢肿瘤、性索-间质肿瘤或转移性卵巢病变。

      • 该研究方案于 2019 年 12 月获得 Assiut 大学医学院机构审查委员会的批准（IRB No.17100871），并获得了 Assiut 大学医学院医学伦理委员会的伦理批准。
      • 研究环境：Assiut 大学医学院病理学系 IHC 实验室。
      • 组织取样：2010 年 1 月至 2021 年 1 月，从 Assiut 大学医院 (AUH) 和南埃及癌症研究所 (SECI) 的外科病理科获得了 62 个福尔马林固定、石蜡包埋的卵巢标本。 这些标本包括：

      (A 组) 22 例恶性卵巢生殖细胞肿瘤 (MOGCT)，(B 组) 20 例表观正常卵巢组织作为对照组，(C 组) 20 例成熟囊性畸胎瘤作为同等良性对照组。

      A 组包括 5 个无性细胞瘤、8 个未成熟畸胎瘤（其中 4 个为 II 级，另外 4 个为 III 级，FIGO 分级系统）和 9 个卵黄囊瘤。 患者的年龄范围为 12 至 23 岁（中位年龄 16.5 岁）。 根据 WHO 卵巢肿瘤分类对每个 MOGCT 的初始诊断进行重新评估。

      B 组包括正常明显的卵巢，手术切除了全腹部子宫切除术和输卵管切除术的标本，用于非卵巢、非恶性原因，如多发性肌瘤子宫和子宫腺肌症作为对照组。 患者年龄从 42 岁到 64 岁不等（中位年龄 50 岁）。

      所有可用的苏木精和伊红染色载玻片均由两名独立的病理学家通过常规光学显微镜检查，最具代表性的一个或两个组织块用于免疫组织化学染色。 根据病理报告评估临床和病理数据，包括年龄、分级、分期、病变复发情况。

      • 免疫组化：组织标本福尔马林固定，石蜡包埋组织块，室温保存。 从选定的代表性组织块上切下 4 um 厚的薄切片，并将其放在涂层载玻片上，在 70°C 的烘箱中保存 25 分钟，通过在两个二甲苯容器中各洗涤 15 分钟来脱蜡，然后通过再水化酒精连续稀释（100%、90%、80%、70%），每次稀释 5 分钟。 然后，切片用 3% 过氧化氢处理 10 分钟以防止非特异性背景，然后用 PBS 缓冲液充分洗涤 4 次。 对于抗原修复，将载玻片保存在柠檬酸盐缓冲液 (PH = 6) 中并在 90-C 下高压灭菌 15 分钟，然后冷却至室温。 玻片用PBS缓冲液充分洗涤4次，组织切片用一抗孵育； p16INK4a 重组兔单克隆抗体 (RM267) (MA5-27905) 1:500 稀释过夜，然后与二抗孵育；多价聚合物-HRP 每一步 10 分钟，然后用 PBS 缓冲液洗涤 4 次。 然后将组织用二氨基联苯胺色原体（DAP-色原体）处理 10 分钟以产生棕色。 然后，切片用 Mayer 苏木精作为复染剂处理 2 分钟。

      对于仅从恶性病例收到的切片，我们添加了额外的 Ki67 IHC 染色，因为组织切片在脱石蜡和 3% 过氧化氢酶封闭后与一抗孵育； Ki67抗体（DAKO），20分钟即可使用，然后与二抗孵育；多价聚合物-HRP 处理 20 分钟，然后用二氨基联苯胺色原体（DAP-色原体）处理 5 分钟以产生棕色显色。 然后，切片用 Mayer 苏木精作为复染剂处理 2 分钟。

      载玻片用自来水清洗，通过连续稀释的酒精脱水，用二甲苯短时间清洗，并用 DPX 封片。

      正常表观卵巢组织用作对照。 来自具有阻断p16表达的宫颈非角化鳞状细胞癌的切片用作阳性对照；未经一抗处理的组织玻片作为阴性对照。

      -免疫组织化学评估：对于 P16 IHC 染色，P16 阳性细胞的百分比和阳性信号（核或细胞质）的位置通过视觉评估所有病变的肿瘤成分。 德国半定量评分系统用于评估P16表达，因为每个肿瘤将根据细胞质和核酸染色的强度给予评分（无染色= 0，弱染色= 1，中度染色= 2，强染色= 3 ) 和染色细胞的程度 (0% = 0, 1-10% = 1, 11-50% =2, 51-80% = 3, 81-100% = 4)。 最终的免疫反应分数将通过强度分数乘以染色细胞的阳性分数的程度来确定，最小分数为 0，最大分数为 12（分数 0、1、2、3、4、6、8、 9 和 12）。

      对于仅针对恶性病例的 KI67 IHC 染色，评估了核阳性染色细胞的百分比，无论所有检查切片的染色强度如何（每个切片至少计数 1000 个肿瘤细胞以估计 KI 指数）。

      -统计分析：使用 IBM-SPSS 24 版分析数据。 数值数据以均值和标准差表示，而分类数据以数量和百分比表示。 描述性统计：计算平均值、标准偏差、中值、范围和百分比。 显着性检验：对于具有两个以上类别的连续变量；计算 ANOVA 检验以检验服从正态分布的数据的平均差异，使用独立样本 Kruskal-Wallis 比较不服从正态分布的组之间的中位差异，使用 Bonferroni 校正计算事后检验。 使用相关性分析（斯皮尔曼等级相关性，2 尾）。

      p 值 < 0.05 被认为是显着的。