Immunhistokemisk evaluering af protein P16-ekspression i ovariekimcelletumorer.

I denne undersøgelse sigter vi mod at:

1-Evaluer den immunhistokemiske ekspression af p16 i neoplastisk komponent af benigne og ondartede OGCT'er og bedømme dens immunreaktivitet.

2-Korrelere mellem P16 immunhistokemisk ekspression i MOGCT'er med Ki 67 prolifererende indeks og FIGO stadieinddeling.

1. Undersøgelsestype: Matchet case-kontrol undersøgelse.

2. Studiefag:

   1. Inklusionskriterier: Forskellige typer kimcelletumorer i æggestokkene, herunder: godartede (modent cystisk teratom) og ondartede (dysgerminom, umoden teratom og blommesæktumor).

   2. Ekskluderingskriterier:

      Ethvert kriterium, der ikke opfylder inklusionskriterierne, såsom andre resekerede ovarietumorer end ovariekimcelletumorer, f.eks. epitheliale ovarietumorer, kønsstrengsstromale tumorer eller metastatiske ovarielæsioner.

      • Undersøgelsesprotokollen blev godkendt af Institutional Review Board på det medicinske fakultet, Assiut University i december 2019 (IRB No.17100871), og etisk godkendelse for denne undersøgelse blev opnået fra udvalget for medicinsk etik, Det medicinske fakultet, Assiut University.
      • Studiemiljø: IHC-lab på patologisk afdeling, Det medicinske fakultet, Assiut Universitet.
      • Vævsprøvetagning: 62 formalinfikserede, paraffinvoksindlejrede ovarieprøver blev opnået fra afdelinger for kirurgisk patologi på Assiut University Hospital (AUH) og South Egypt cancer Institute (SECI) fra januar 2010 til januar 2021. Disse eksemplarer inkluderer:

      (Gruppe A) 22 maligne ovariekimcelletumorer (MOGCT'er), (Gruppe B) 20 tilsyneladende normalt ovarievæv som kontrolgruppe og (Gruppe C) 20 modne cystiske teratomer som ensartede benigne sammenligningsgruppe.

      Gruppe A udgør 5 dysgerminomer, 8 umodne teratomer (fire af dem grad II og de andre fire er grad III, FIGO-graderingssystem) og 9 blommesæktumorer. Patienterne var i alderen 12 til 23 år (medianalder 16,5 år). Den indledende diagnose af hver MOGCT blev revurderet i henhold til WHO's klassifikation af ovarietumorer.

      Gruppe B inkluderer normalt tilsyneladende ovarier, der kirurgisk reseceret med prøver af total abdominal hysterektomi og salpingo-oferktomi for ikke-ovarie, ikke-maligne årsager som multipel fibroid uterus og adenomyose som kontrolgruppe. Patienterne var i alderen fra 42 til 64 år (median 50 år).

      Alle tilgængelige hæmatoxylin- og eosin-farvede objektglas blev undersøgt af to uafhængige patologer ved rutinemæssig lysmikroskopi, og den mest repræsentative en eller to vævsblokke blev brugt til immunhistokemisk farvning. De kliniske og patologiske data omfatter alder, grad, stadie, gentagelse af læsioner blev evalueret i henhold til patologiske rapporter.

      • Immunhistokemi: Vævsprøverne var formalinfikserede, paraffinindlejrede vævsblokke og blev opbevaret ved stuetemperatur. Tynde sektioner med en tykkelse på 4 um blev skåret fra udvalgte repræsentative vævsblokke og blev overført til coatede objektglas, holdt i en ovn ved 70-C i 25 minutter, afparaffineret ved vask i to beholdere med xylen i 15 minutter for hver og rehydreret gennem seriefortyndinger (100 % , 90 % , 80 % , 70 %) alkohol i 5 minutter i hver fortynding. Derefter blev sektioner behandlet med 3% hydrogenperoxid i 10 minutter for at forhindre uspecifik baggrund efterfulgt af PBS-buffervask 4 gange tilstrækkeligt. Til antigenudvinding blev objektglassene opbevaret i citratbuffer (PH = 6) og autoklaveret ved 90-C i 15 minutter og efterladt til afkøling til stuetemperatur. Objektglassene blev vasket med PBS-buffer 4 gange tilstrækkeligt, og vævssnittene blev inkuberet med primært antistof; p16INK4a rekombinant monoklonalt kaninantistof (RM267) (MA5-27905) ved en fortynding på 1:500 natten over, efterfulgt af inkubation med sekundært antistof; Polyvalent polymer-HRP i 10 minutter for hvert trin efterfulgt af tilstrækkelig 4 gange PBS-buffervask. Vævene blev derefter behandlet med Diaminobenzidin-chromogen (DAP-chromogen) til brun farveudvikling i 10 minutter. Derefter blev sektioner behandlet med Mayer-hæmatoxylin som modfarvning i 2 minutter.

      For kun sektioner modtaget fra maligne tilfælde tilføjer vi yderligere Ki67 IHC-farvning, da vævssnit efter deparffinisering og blokering med 3% hydrogenperoxidase blev inkuberet med primært antistof; Ki67-antistof (DAKO), klar til brug i 20 minutter, efterfulgt af inkubation med sekundært antistof; Polyvalent polymer-HRP i 20 minutter, efterfulgt af behandling med Diaminobenzidin-chromogen (DAP-chromogen) for udvikling af brun farve i 5 minutter. Derefter blev sektioner behandlet med Mayer-hæmatoxylin som modfarvning i 2 minutter.

      Objektglassene blev vasket med postevand, dehydreret gennem serielle fortyndinger af alkohol, vasket med xylen i en kort periode og monteret med DPX.

      Det normale tilsyneladende ovarievæv blev anvendt som kontroller. Sektioner fra cervikal ikke-keratiniseret pladecellecarcinom med blok p16-ekspression blev brugt som positive kontroller; og vævsglassene uden den primære antistofbehandling tjente som de negative kontroller.

      -Immunohistokemisk evaluering: For P16 IHC-farvning blev procentdelen af ​​P16 positive celler og placeringen af ​​positive signaler (nuklear eller cytoplasmatisk) visuelt estimeret for neoplastiske komponenter af alle læsioner. Tysk semi-kvantitativt scoringssystem blev brugt til at evaluere P16-ekspression, da hver tumor vil blive givet en score i henhold til intensiteten af ​​cytoplasmatisk og nukleinfarvning (ingen farvning = 0, svag farvning = 1, moderat farvning = 2, stærk farvning = 3 ) Og omfanget af farvede celler (0% = 0, 1-10% = 1, 11-50% =2, 51-80% = 3, 81-100% = 4). Den endelige immunoreaktive score vil blive bestemt ved at multiplicere intensitetsscorerne med omfanget af positivitetsscorer for farvede celler, med minimumscore på 0 og en maksimal score på 12 (score 0, 1,2,3,4,6,8, 9 og 12).

      For KI67 IHC-farvning kun for maligne tilfælde blev procentdelen af ​​nuklear positivitet farvede celler vurderet, uanset intensiteten af ​​farvning i alle undersøgte sektioner (mindst 1000 tumorceller blev talt pr. sektion til estimering af KI-indeks).

      -Statistisk analyse: Data blev analyseret ved hjælp af IBM-SPSS version 24. Numeriske data blev præsenteret som gennemsnit og standardafvigelse, mens kategoriske data blev præsenteret som antal og procent. Beskrivende statistik: Middelværdier, standardafvigelser, medianer, intervaller og procenter blev beregnet. Signifikanstest: for kontinuerte variable med mere end to kategorier; ANOVA-testen blev beregnet for at teste de gennemsnitlige forskelle af dataene, der følger normalfordelingen, og uafhængig prøve Kruskal-Wallis blev brugt til at sammenligne medianforskellen mellem grupper, der ikke følger normalfordelingen, post-hoc-testen blev beregnet ved hjælp af Bonferroni-korrektioner. Korrelationsanalyse blev brugt (Spearman' Ranking korrelation, 2-tailed).

      En p-værdi < 0,05 blev betragtet som signifikant.