A P16 fehérje expressziójának immunhisztokémiai értékelése petefészek csírasejtes daganatokban.

Ebben a tanulmányban arra törekszünk, hogy:

1. Értékelje a p16 immunhisztokémiai expresszióját jóindulatú és rosszindulatú OGCT-k neoplasztikus komponensében, és értékelje immunreaktivitását.

2-Korreláció a P16 immunhisztokémiai expressziója között a Ki 67 proliferációs indexű MOGCT-ben és a FIGO stádiumban.

1. A vizsgálat típusa: Párosított eset-kontroll vizsgálat.

2. Tantárgyak:

   1. Bevételi kritériumok: A petefészek csírasejtes daganatainak különböző típusai, beleértve a jóindulatú (érett cisztás teratoma) és a rosszindulatú daganatokat (dysgerminoma, éretlen teratoma és tojássárgája-tumor).

   2. Kizárási kritériumok:

      Bármilyen kritérium, amely nem felel meg a beválasztási kritériumoknak, mint például a petefészek csírasejt-daganatától eltérő, kimetszett petefészekdaganatok, például epiteliális petefészek-daganatok, nemi zsinór-sztróma daganatok vagy áttétes petefészek-elváltozások.

      • A vizsgálati protokollt az Assiut Egyetem Orvostudományi Karának Intézményi Ellenőrző Bizottsága hagyta jóvá 2019 decemberében (IRB No.17100871), és ehhez a vizsgálathoz az Assiut Egyetem Orvostudományi Karának Orvosetikai Bizottsága kapta meg az etikai jóváhagyást.
      • Tanulmányi környezet: Az Assiut Egyetem Orvostudományi Karának Patológiai Tanszékének IHC laborja.
      • Szövetmintavétel: 2010 januárja és 2021 januárja között hatvankét formalinnal fixált, paraffinviaszba ágyazott petefészekmintát vettek az Assiut Egyetemi Kórház (AUH) és a Dél-Egyiptom Rákkutató Intézet (SECI) sebészeti patológiai osztályairól. Ezek a minták a következőket tartalmazzák:

      (A csoport) 22 rosszindulatú petefészek csírasejtes tumor (MOGCT), (B csoport) 20 látszólagos normális petefészekszövet kontrollcsoportként és (C csoport) 20 érett cisztás teratoma, mint azonos jóindulatú összehasonlító csoport.

      Az A csoport 5 dysgerminomát, 8 éretlen teratomát (ebből négy II. fokozatú, a másik négy III. fokozatú, FIGO osztályozási rendszer) és 9 tojássárgája-tumort tartalmaz. A betegek életkora 12 és 23 év között volt (átlagéletkor 16,5 év). Az egyes MOGCT-k kezdeti diagnózisát a WHO petefészektumorok osztályozása szerint újraértékelték.

      A B csoportba tartoznak a normálisan látható petefészkek, amelyeket sebészileg eltávolítottak teljes hasi méheltávolítás és salpingo-oferktómia mintáival nem petefészek, nem rosszindulatú okok miatt, mint többszörös méhfibrám és adenomiózis, mint kontrollcsoport. A betegek életkora 42 és 64 év között volt (átlagosan 50 év).

      Az összes rendelkezésre álló hematoxilinnal és eozinnal festett tárgylemezt két független patológus rutin fénymikroszkóppal vizsgálta meg, és a legreprezentatívabb egy vagy két szövetblokkot használtuk az immunhisztokémiai festéshez. A klinikai és patológiai adatok közé tartozik az életkor, a fokozat, a stádium, az elváltozások kiújulását a patológiai jelentések alapján értékeltük.

      • Immunhisztokémia: A szövetminták formalinban fixált, paraffinba ágyazott szövetblokkok voltak, és szobahőmérsékleten tároltuk. Vékony, 4 um vastagságú metszeteket vágtunk ki kiválasztott reprezentatív szövettömbökből, és bevont tárgylemezekre vittük, kemencében 70 °C-on tartottuk 25 percig, majd paraffinmentesítettük két xilolos tartályban történő mosással 15 percig, majd rehidratáltuk. sorozathígítások (100 % , 90 % , 80 % , 70 %) alkoholt 5 percig minden hígításban. Ezután a metszeteket 3%-os hidrogén-peroxiddal kezeltük 10 percig, hogy megakadályozzuk a nem specifikus háttér kialakulását, majd négyszer megfelelően mossuk PBS pufferrel. Az antigén visszanyeréséhez a lemezeket citrát pufferben (PH=6) tartottuk, és 90 °C-on 15 percig autoklávoztuk, majd szobahőmérsékletre hűlni hagytuk. A lemezeket PBS-pufferrel 4-szer megfelelően mostuk, és a szövetmetszeteket elsődleges antitesttel inkubáltuk; p16INK4a Rekombináns nyúl monoklonális antitest (RM267) (MA5-27905) 1:500 hígításban egy éjszakán át, majd inkubálás másodlagos antitesttel; Többértékű polimer-HRP 10 percig minden lépésben, majd megfelelő 4-szeres PBS puffermosás. A szöveteket ezután diaminobenzidin kromogénnel (DAP-kromogén) kezeltük a barna szín kialakulásához 10 percig. Ezután a metszeteket Mayer-hematoxilinnal kezeltük ellenfestékként 2 percig.

      A csak rosszindulatú esetekből származó metszeteknél további Ki67 IHC-festést adunk, mivel a parffinmentesítés és a 3%-os hidrogén-peroxidázzal történő blokkolt szövetmetszeteket elsődleges antitesttel inkubáltuk; Ki67 antitest (DAKO), 20 percig használatra kész, majd másodlagos antitesttel történő inkubálás; Többértékű polimer-HRP 20 percig, majd diaminobenzidin kromogénnel (DAP-kromogén) történő kezelés a barna szín kialakulásához 5 percig. Ezután a metszeteket Mayer-hematoxilinnal kezeltük ellenfestékként 2 percig.

      A tárgylemezeket csapvízzel mostuk, alkohol sorozatos hígításaival dehidratáltuk, rövid ideig xilollal mostuk, és DPX-el szereltük fel.

      Kontrollként a normális látszólagos petefészekszöveteket használtuk. Pozitív kontrollként a p16-expressziót blokkoló nyaki nem keratinizált laphámsejtes karcinómából származó metszeteket használtuk; és az elsődleges antitestkezelés nélküli szövetlemezek negatív kontrollként szolgáltak.

      - Immunhisztokémiai értékelés: A P16 IHC festéshez vizuálisan megbecsültük a P16 pozitív sejtek százalékos arányát és a pozitív (nukleáris vagy citoplazmatikus) jelek elhelyezkedését az összes lézió neoplasztikus komponensére vonatkozóan. Német szemikvantitatív pontozási rendszert használtak a P16 expressziójának értékelésére, mivel minden daganat a citoplazmatikus és nukleáris festődés intenzitása szerint kap pontot (nincs festődés = 0, gyenge festődés = 1, közepes festődés = 2, erős festődés = 3). ) És a festett sejtek kiterjedése (0% = 0, 1-10% = 1, 11-50% =2, 51-80% = 3, 81-100% = 4). A végső immunreaktív pontszámot úgy határozzuk meg, hogy az intenzitási pontszámokat megszorozzuk a festett sejtek pozitivitási pontszámával, a minimális pontszám 0 és a maximális pontszám 12 (pontszám 0, 1,2,3,4,6,8, 9. és 12.).

      A KI67 IHC-festésnél csak rosszindulatú esetekben a sejtmag-pozitív festett sejtek százalékos arányát értékeltük, függetlenül a festődés intenzitásától az összes vizsgált metszetben (a KI-index becsléséhez metszetenként legalább 1000 tumorsejtet számoltunk).

      - Statisztikai elemzés: Az adatok elemzése az IBM-SPSS 24-es verziójával történt. A numerikus adatokat átlagban és szórásban, míg a kategorikus adatokat számban és százalékban adtuk meg. Leíró statisztikák: Átlagokat, szórásokat, mediánokat, tartományokat és százalékokat számítottunk ki. A szignifikancia tesztje: kettőnél több kategóriájú folytonos változókra; A normál eloszlást követő adatok átlagos különbségeinek tesztelésére ANOVA tesztet számoltunk, és független mintát Kruskal-Wallis-t használtunk a normál eloszlást nem követő csoportok közötti medián különbség összehasonlítására, a post-hoc tesztet Bonferroni korrekciókkal számoltuk. Korrelációs elemzést alkalmaztunk (Spearman rangsorolt ​​korreláció, 2-farkú).

      A 0,05-nél kisebb p-értéket szignifikánsnak tekintettük.