난소 생식세포 종양에서 P16 단백질 발현의 면역조직화학적 평가

이 연구에서는 다음을 목표로 합니다.

1- 양성 및 악성 OGCT의 종양 구성 요소에서 p16의 면역조직화학적 발현을 평가하고 면역 반응성을 평가합니다.

2- Ki 67 증식 지수를 갖는 MOGCT에서의 P16 면역조직화학적 발현과 FIGO 병기 사이의 상관관계.

1. 연구 유형: 일치 사례-대조군 연구.

2. 연구 주제:

   1. 포함 기준: 양성(성숙한 낭성 기형종) 및 악성 종양(배엽형성이상종, 미성숙 기형종 및 난황낭 종양)을 포함하는 다양한 유형의 난소 생식 세포 종양.

   2. 제외 기준:

      난소 생식 세포 종양 이외의 절제된 난소 종양(예: 상피성 난소 종양, 성삭 간질 종양 또는 전이성 난소 병변)과 같이 포함 기준을 충족하지 않는 모든 기준.

      • 연구 프로토콜은 2019년 12월 Assiut University 의과대학 Institutional Review Board의 승인을 받았으며(IRB No.17100871) 본 연구에 대한 윤리적 승인은 Assiut University 의과대학 의료윤리위원회로부터 획득되었습니다.
      • 연구 환경: Assiut University 의학부 병리학과 IHC 연구실.
      • 조직 샘플링: 2010년 1월부터 2021년 1월까지 AUH(Assiut University Hospital) 및 SECI(South Egypt Cancer Institute)의 외과 병리과에서 62개의 포르말린 고정, 파라핀 왁스 내장 난소 표본을 얻었습니다. 이 표본에는 다음이 포함됩니다.

      (그룹 A) 22개의 악성 난소 생식 세포 종양(MOGCT), (그룹 B) 대조군으로서 20개의 겉보기 정상 난소 조직 및 (그룹 C) 동등한 양성 비교 그룹으로서 20개의 성숙한 낭포성 기형종.

      그룹 A는 5개의 생식세포종, 8개의 미성숙 기형종(그 중 4개는 등급 II이고 나머지 4개는 등급 III, FIGO 등급 시스템임) 및 9개의 난황낭 종양으로 구성됩니다. 환자의 나이는 12세에서 23세(평균 연령 16.5세)였습니다. 각 MOGCT의 초기 진단은 WHO 난소 종양 분류에 따라 재평가되었습니다.

      그룹 B는 대조군으로서 다발성 섬유종 자궁 및 자궁선근증과 같은 비-난소, 비-악성 원인에 대한 전체 복식 자궁적출술 및 난관-난소절제술 표본으로 외과적으로 절제된 정상적으로 보이는 난소를 포함한다. 환자의 나이는 42세에서 64세(중앙값 50세)였습니다.

      사용 가능한 모든 헤마톡실린 및 에오신 염색 슬라이드는 일상적인 광학 현미경으로 2명의 독립적인 병리학자에 의해 검사되었고 가장 대표적인 1개 또는 2개의 조직 블록이 면역조직화학 염색에 사용되었습니다. 임상 및 병리학적 데이터는 연령, 등급, 병기, 병변의 재발을 포함하고 병리학적 보고에 따라 평가하였다.

      • 면역조직화학: 조직 샘플은 포르말린 고정, 파라핀 내장 조직 블록이었고 실온에서 보관되었습니다. 선택된 대표적인 조직 블록에서 4um 두께의 얇은 절편을 잘라내어 코팅된 슬라이드에 놓고 70℃의 오븐에서 25분 동안 유지한 후 각각 15분 동안 두 개의 크실렌 용기에서 세척하여 파라핀을 제거하고 각 희석에서 5분 동안 알코올의 연속 희석(100% , 90% , 80% , 70%). 그런 다음 절편을 3% 과산화수소로 10분 동안 처리하여 비특이적 배경을 방지한 다음 PBS 완충액으로 4회 적절하게 세척했습니다. 항원 검색을 위해 슬라이드를 구연산 완충액(PH = 6)에 보관하고 90℃에서 15분 동안 오토클레이브한 다음 실온으로 냉각되도록 두었습니다. 슬라이드를 PBS 완충액으로 4회 적절하게 세척하고 조직 절편을 1차 항체와 함께 배양했습니다. p16INK4a Recombinant Rabbit Monoclonal Antibody (RM267) (MA5-27905)를 1:500의 희석률로 밤새도록 한 후 2차 항체와 함께 배양합니다. 각 단계에 대해 10분 동안 다가 폴리머-HRP를 처리한 후 PBS 버퍼 세척을 4회 적절하게 수행합니다. 그런 다음 조직을 갈색 발색을 위해 10분 동안 Diaminobenzidine chromogen(DAP-chromogen)으로 처리했습니다. 그런 다음 섹션을 2분 동안 카운터 염색으로 Mayer hematoxylin으로 처리했습니다.

      악성 사례에서만 받은 절편의 경우 탈파르핀화 후 조직 절편으로 추가 Ki67 IHC 염색을 추가하고 3% 과산화수소에 의한 차단을 1차 항체와 함께 배양했습니다. Ki67 항체(DAKO), 20분 동안 사용할 준비가 된 후 2차 항체와 함께 배양; 다가 고분자-HRP를 20분 동안 처리한 후, 5분 동안 갈색 발색을 위해 Diaminobenzidine chromogen(DAP-chromogen)으로 처리했습니다. 그런 다음 섹션을 2분 동안 카운터 염색으로 Mayer hematoxylin으로 처리했습니다.

      슬라이드를 수돗물로 세척하고, 일련의 알코올 희석을 통해 탈수하고, 짧은 시간 동안 자일렌으로 세척하고, DPX로 장착했습니다.

      정상적인 겉보기 난소 조직을 대조군으로 사용했습니다. 블록 p16 발현이 있는 자궁경부 각질화되지 않은 편평 세포 암종의 섹션을 양성 대조군으로 사용했습니다. 1차 항체 처리가 없는 조직 슬라이드는 음성 대조군으로 사용되었습니다.

      -면역조직화학적 평가: P16 IHC 염색의 경우, 모든 병변의 신생물 성분에 대해 P16 양성 세포의 백분율 및 양성 신호(핵 또는 세포질)의 위치를 ​​육안으로 추정하였다. 모든 종양에 세포질 및 핵산 염색의 강도에 따라 점수가 부여되므로 German Semi-quantitative score system을 사용하여 P16 발현을 평가했습니다(염색 없음 = 0, 약한 염색 = 1, 보통 염색 = 2, 강한 염색 = 3). ) 및 염색된 세포의 정도(0% = 0, 1-10% = 1, 11-50% =2, 51-80% = 3, 81-100% = 4). 최종 면역 반응 점수는 강도 점수에 염색된 세포의 양성 점수 정도를 곱하여 결정되며, 최소 점수는 0점, 최대 점수는 12점(점수 0, 1,2,3,4,6,8, 9 및 12).

      악성 사례에 대한 KI67 IHC 염색의 경우, 검사된 모든 섹션의 염색 강도에 관계없이 핵 양성 염색 세포의 백분율을 평가했습니다(KI 지수 추정을 위해 섹션당 최소 1000개의 종양 세포가 계산됨).

      -통계분석: IBM-SPSS version 24를 이용하여 데이터를 분석하였다. 수치 데이터는 평균과 표준편차로, 범주 데이터는 숫자와 백분율로 나타내었다. 기술 통계: 평균, 표준 편차, 중앙값, 범위 및 백분율을 계산했습니다. 유의성 검정: 범주가 세 개 이상인 연속 변수의 경우 정규분포를 따르는 데이터의 평균차이를 검정하기 위해 ANOVA 검정을 계산하였고, 정규분포를 따르지 않는 집단 간의 중앙값 차이를 비교하기 위해 독립 표본 Kruskal-Wallis를 사용하였고, Bonferroni 보정을 사용하여 사후검정을 계산하였다. 상관 분석이 사용되었습니다(Spearman' Ranked correlation, 2-tailed).

      p-값 < 0.05는 유의한 것으로 간주되었습니다.