Immunhistokjemisk evaluering av protein P16-ekspresjon i ovarie-kimcelletumorer.

I denne studien har vi som mål å:

1-Vurder det immunhistokjemiske uttrykket av p16 i neoplastisk komponent av godartede og ondartede OGCT-er og skårer dens immunreaktivitet.

2-Korrelere mellom P16 immunhistokjemisk uttrykk i MOGCTs med Ki 67 prolifererende indeks og FIGO stadieinndeling.

1. Type studie: Matchet case-control studie.

2. Studieemner:

   1. Inklusjonskriterier: Ulike typer kimcelletumorer i eggstokkene inkludert: godartede (modent cystisk teratom) og ondartede (dysgerminom, umoden teratom og plommesekktumor).

   2. Ekskluderingskriterier:

      Alle kriterier som ikke oppfyller inklusjonskriteriene, slik som resekerte ovarietumorer andre enn ovarialcelletumorer, f.eks. epiteliale ovariesumorer, kjønnsstrengstromale svulster eller metastatiske ovarialesjoner.

      • Studieprotokollen ble godkjent av Institutional Review Board ved Det medisinske fakultet, Assiut University i desember 2019 (IRB No.17100871) og etisk godkjenning for denne studien ble innhentet fra komiteen for medisinsk etikk, Det medisinske fakultet, Assiut University.
      • Studiemiljø: IHC-lab ved Patologiavdelingen, Det medisinske fakultet, Assiut University.
      • Vevsprøvetaking: Sekstito formalinfikserte, parafinvoksinnstøpte eggstokkprøver ble hentet fra avdelinger for kirurgisk patologi ved Assiut University Hospital (AUH) og South Egypt cancer Institute (SECI) fra januar 2010 til januar 2021. Disse prøvene inkluderer:

      (Gruppe A) 22 ondartede ovarie-kimcelletumorer (MOGCTs), (Gruppe B) 20 tilsynelatende normalt ovarievev som kontrollgruppe og (Gruppe C) 20 modne cystiske teratomer som lik benigne sammenligningsgruppe.

      Gruppe A utgjør 5 dysgerminomer, 8 umodne teratomer (fire av dem grad II og de andre fire er grad III, FIGO-graderingssystem) og 9 plommesekksvulster. Pasientene varierte i alder fra 12 til 23 år (median alder 16,5 år). Den første diagnosen for hver MOGCT ble re-evaluert i henhold til WHOs klassifisering av ovarietumorer.

      Gruppe B inkluderer normalt tilsynelatende eggstokker som kirurgisk reseksjonert med prøver av total abdominal hysterektomi og salpingo-oferktomi for ikke-ovarie, ikke-maligne årsaker som multippel fibroid uterus og adenomyose som en kontrollgruppe. Pasientene varierte i alder fra 42 til 64 år (median 50 år).

      Alle tilgjengelige hematoxylin- og eosinfargede objektglass ble undersøkt av to uavhengige patologer ved rutinemessig lysmikroskopi, og de mest representative én eller to vevsblokkene ble brukt til immunhistokjemisk farging. De kliniske og patologiske dataene inkluderer alder, grad, stadium, tilbakefall av lesjoner ble evaluert i henhold til patologiske rapporter.

      • Immunhistokjemi: Vevsprøvene var formalinfikserte, parafininnstøpte vevsblokker, og ble lagret ved romtemperatur. Tynne seksjoner med 4 um tykkelse ble kuttet fra utvalgte representative vevsblokker og ble tatt på belagte objektglass, holdt i en ovn ved 70-C i 25 minutter, avparafinisert ved vask i to beholdere med xylen i 15 minutter for hver og rehydrert gjennom seriefortynninger (100 % , 90 % , 80 % , 70 %) alkohol i 5 minutter i hver fortynning. Deretter ble seksjoner behandlet med 3% hydrogenperoksid i 10 minutter for å forhindre uspesifikk bakgrunn etterfulgt av PBS-buffervask 4 ganger tilstrekkelig. For utvinning av antigen ble objektglassene holdt i sitratbuffer (PH = 6) og autoklaveret ved 90-C i 15 minutter og avkjølt til romtemperatur. Objektglassene ble vasket med PBS-buffer 4 ganger tilstrekkelig og vevssnittene ble inkubert med primært antistoff; p16INK4a rekombinant kanin monoklonalt antistoff (RM267) (MA5-27905) ved en fortynning på 1:500 over natten, etterfulgt av inkubasjon med sekundært antistoff; Polyvalent polymer-HRP i 10 minutter for hvert trinn etterfulgt av tilstrekkelig 4 ganger PBS-buffervask. Vevet ble deretter behandlet med Diaminobenzidin-kromogen (DAP-kromogen) for brunfargeutvikling i 10 minutter. Deretter ble seksjoner behandlet med Mayer hematoxylin som motfarging i 2 minutter.

      For seksjoner mottatt kun fra ondartede tilfeller, legger vi til ytterligere Ki67 IHC-farging som vevssnitt etter deparffinisering og blokkering med 3 % hydrogenperoksidase ble inkubert med primært antistoff; Ki67-antistoff (DAKO), klar til bruk i 20 minutter, etterfulgt av inkubasjon med sekundært antistoff; Polyvalent polymer-HRP i 20 minutter, etterfulgt av behandling med Diaminobenzidin-kromogen (DAP-kromogen) for utvikling av brun farge i 5 minutter. Deretter ble seksjoner behandlet med Mayer hematoxylin som motfarging i 2 minutter.

      Objektglassene ble vasket med vann fra springen, dehydrert gjennom seriefortynninger av alkohol, vasket med xylen i en kort periode og montert med DPX.

      Det normale tilsynelatende eggstokkvevet ble brukt som kontroller. Snitt fra cervikal ikke-keratinisert plateepitelkarsinom med blokk p16-ekspresjon ble brukt som positive kontroller; og vevsglassene uten den primære antistoffbehandlingen tjente som de negative kontrollene.

      -Immunohistokjemisk evaluering: For P16 IHC-farging ble prosentandelen av P16 positive celler og plasseringen av positive signaler (kjerne eller cytoplasmatisk) visuelt estimert for neoplastiske komponenter av alle lesjoner. Tysk semi-kvantitativ skåringssystem ble brukt for å evaluere P16-ekspresjon, da hver svulst vil bli gitt en skår i henhold til intensiteten av cytoplasmatisk og nukleinfarging (ingen farging = 0, svak farging = 1, moderat farging = 2, sterk farging = 3 ) Og omfanget av fargede celler (0% = 0, 1-10% = 1, 11-50% =2, 51-80% = 3, 81-100% = 4). Den endelige immunoreaktive poengsummen vil bli bestemt ved å multiplisere intensitetsskårene med graden av positivitetsskårer for fargede celler, med minimumsskåren på 0 og en maksimal poengsum på 12 (skåren 0, 1,2,3,4,6,8, 9 og 12).

      For KI67 IHC-farging kun for ondartede tilfeller, ble prosentandelen av nukleær positivitet fargede celler vurdert, uavhengig av intensiteten av farging i alle undersøkte seksjoner (minst 1000 tumorceller ble talt per seksjon for estimering av KI-indeks).

      -Statistisk analyse: Data ble analysert med IBM-SPSS versjon 24. Numeriske data ble presentert som gjennomsnitt og standardavvik, mens kategoriske data ble presentert som antall og prosent. Beskrivende statistikk: Gjennomsnitt, standardavvik, medianer, områder og prosenter ble beregnet. Signifikanstest: for kontinuerlige variabler med mer enn to kategorier; ANOVA-testen ble beregnet for å teste gjennomsnittsforskjellene til dataene som følger normalfordelingen og uavhengig prøve Kruskal-Wallis ble brukt for å sammenligne medianforskjellen mellom grupper som ikke følger normalfordelingen, post-hoc test ble beregnet ved bruk av Bonferroni-korreksjoner. Korrelasjonsanalyse ble brukt (Spearman'-rangert korrelasjon, 2-tailed).

      En p-verdi < 0,05 ble ansett som signifikant.