Immunohistochemiczna ocena ekspresji białka P16 w nowotworach zarodkowych jajnika.

W tym badaniu chcemy:

1-Ocena immunohistochemicznej ekspresji p16 w komponencie nowotworowym łagodnych i złośliwych OGCT oraz ocena jego immunoreaktywności.

2-Korelacja między ekspresją immunohistochemiczną P16 w MOGCT z indeksem proliferacyjnym Ki 67 i stopniem zaawansowania FIGO.

1. Rodzaj badania: Dopasowane badanie kliniczno-kontrolne.

2. Przedmioty studiów:

   1. Kryteria włączenia: Różne typy guzów zarodkowych jajnika, w tym: łagodne (dojrzały potworniak torbielowaty) i złośliwe (dysgerminoma, niedojrzały potworniak i guz woreczka żółtkowego).

   2. Kryteria wyłączenia:

      Wszelkie kryteria, które nie spełniają kryteriów włączenia, takie jak wycięte guzy jajnika inne niż guzy zarodkowe jajnika, np. nabłonkowe guzy jajnika, guzy podścieliska ze sznurów płciowych lub przerzutowe zmiany jajnika.

      • Protokół badania został zatwierdzony przez Institutional Review Board na Wydziale Lekarskim Uniwersytetu w Assiut w grudniu 2019 r. (nr IRB 17100871), a zgodę etyczną na to badanie uzyskała komisja etyki lekarskiej na Wydziale Lekarskim Uniwersytetu w Assiut.
      • Miejsce nauki: Laboratorium IHC wydziału patologii Wydziału Lekarskiego Uniwersytetu Assiut.
      • Pobieranie próbek tkanek: Sześćdziesiąt dwa utrwalone w formalinie i zatopione w parafinie próbki jajników pobrano z oddziałów patologii chirurgicznej Szpitala Uniwersyteckiego Assiut (AUH) i South Egypt Cancer Institute (SECI) od stycznia 2010 r. do stycznia 2021 r. Te okazy obejmują:

      (Grupa A) 22 złośliwe guzy zarodkowe jajnika (MOGCT), (Grupa B) 20 widocznych prawidłowych tkanek jajnika jako grupa kontrolna i (Grupa C) 20 dojrzałych potworniaków torbielowatych jako równa łagodna grupa porównawcza.

      Grupę A stanowi 5 dysgerminoma, 8 niedojrzałych potworniaków (cztery z nich II stopnia, a pozostałe cztery stopnia III wg FIGO) oraz 9 guzów woreczka żółtkowego. Pacjenci byli w wieku od 12 do 23 lat (mediana wieku 16,5 roku). Wstępne rozpoznanie każdego MOGCT zostało ponownie ocenione zgodnie z klasyfikacją guzów jajnika WHO.

      Grupa B obejmuje normalnie widoczne jajniki, które usunięto chirurgicznie wycinkami z całkowitej histerektomii brzusznej i salpingo-ofertektomii z przyczyn niezwiązanych z jajnikami, niezłośliwych, takich jak mnogie włókniaki macicy i adenomioza jako grupa kontrolna. Pacjenci byli w wieku od 42 do 64 lat (mediana 50 lat).

      Wszystkie dostępne preparaty barwione hematoksyliną i eozyną zostały zbadane przez dwóch niezależnych patologów za pomocą rutynowej mikroskopii świetlnej, a najbardziej reprezentatywny jeden lub dwa bloki tkanki zostały użyte do barwienia immunohistochemicznego. Dane kliniczne i patologiczne obejmują wiek, stopień zaawansowania, stopień zaawansowania, nawrót zmian oceniano zgodnie z raportami patologicznymi.

      • Immunohistochemia: Próbki tkanek utrwalono w formalinie, zatopiono w parafinie bloczki tkankowe i przechowywano w temperaturze pokojowej. Cienkie skrawki o grubości 4 µm wycięto z wybranych reprezentatywnych bloków tkanek i przeniesiono na powlekane szkiełka, przetrzymywano w piecu w temperaturze 70°C przez 25 minut, odparafinowano przez przemywanie w dwóch pojemnikach z ksylenem przez 15 minut dla każdego i ponownie uwodniono przez seryjne rozcieńczenia (100%, 90%, 80%, 70%) alkoholu przez 5 minut w każdym rozcieńczeniu. Następnie skrawki traktowano 3% nadtlenkiem wodoru przez 10 minut, aby zapobiec niespecyficznemu tłu, a następnie odpowiednio 4 razy przemywano buforem PBS. W celu odzyskania antygenu szkiełka przechowywano w buforze cytrynianowym (PH = 6) i autoklawowano w temperaturze 90°C przez 15 minut i pozostawiono do ostygnięcia do temperatury pokojowej. Szkiełka odpowiednio przemyto buforem PBS 4 razy i skrawki tkanki inkubowano z pierwszorzędowym przeciwciałem; p16INK4a rekombinowane królicze przeciwciało monoklonalne (RM267) (MA5-27905) w rozcieńczeniu 1:500 przez noc, a następnie inkubacja z drugorzędowym przeciwciałem; Poliwalentny polimer-HRP przez 10 minut na każdy etap, a następnie odpowiednie 4-krotne przemycie buforem PBS. Następnie tkanki traktowano chromogenem diaminobenzydyny (chromogen DAP) w celu uzyskania brązowego zabarwienia przez 10 minut. Następnie skrawki traktowano hematoksyliną Mayera jako barwnikiem kontrastowym przez 2 minuty.

      W przypadku skrawków otrzymanych wyłącznie od przypadków złośliwych dodaliśmy dodatkowe barwienie Ki67 IHC, ponieważ skrawki tkanek po odparfinowaniu i zablokowaniu 3% peroksydazą wodorową inkubowano z pierwszorzędowym przeciwciałem; przeciwciało Ki67 (DAKO), gotowe do użycia przez 20 minut, a następnie inkubacja z przeciwciałem drugorzędowym; Poliwalentny polimer-HRP przez 20 minut, a następnie traktowanie chromogenem diaminobenzydyny (chromogen DAP) w celu uzyskania brązowego zabarwienia przez 5 minut. Następnie skrawki traktowano hematoksyliną Mayera jako barwnikiem kontrastowym przez 2 minuty.

      Szkiełka przemyto wodą wodociągową, odwodniono przez seryjne rozcieńczenia alkoholu, przemyto ksylenem przez krótki czas i zamontowano z DPX.

      Normalne pozorne tkanki jajnika zastosowano jako kontrole. Skrawki z nierogowaciejącego raka płaskonabłonkowego szyjki macicy z blokiem ekspresji p16 zastosowano jako kontrole pozytywne; a preparaty tkankowe bez pierwotnego traktowania przeciwciałem służyły jako kontrole negatywne.

      -Ocena immunohistochemiczna: W przypadku barwienia P16 IHC procent komórek P16-dodatnich i lokalizacja pozytywnych sygnałów (jądrowe lub cytoplazmatyczne) zostały wizualnie oszacowane dla składników nowotworowych wszystkich zmian. Do oceny ekspresji P16 zastosowano niemiecki półilościowy system punktacji, ponieważ każdemu nowotworowi zostanie przyznana ocena zgodnie z intensywnością barwienia cytoplazmy i jąder (brak barwienia = 0, słabe barwienie = 1, umiarkowane barwienie = 2, silne barwienie = 3 ) I stopień zabarwienia komórek (0% = 0, 1-10% = 1, 11-50% = 2, 51-80% = 3, 81-100% = 4). Końcowy wynik immunoreaktywny zostanie określony przez pomnożenie wyników intensywności przez zakres wyników dodatnich wybarwionych komórek, przy minimalnym wyniku 0 i maksymalnym wyniku 12 (wynik 0, 1,2,3,4,6,8, 9 i 12).

      W przypadku barwienia KI67 IHC tylko w przypadkach złośliwych, oceniano odsetek komórek wybarwionych z dodatnim wynikiem jądrowym, niezależnie od intensywności barwienia we wszystkich badanych skrawkach (co najmniej 1000 komórek nowotworowych zliczono na skrawek w celu oszacowania wskaźnika KI).

      -Analiza statystyczna: Dane zostały przeanalizowane przy użyciu IBM-SPSS w wersji 24. Dane liczbowe przedstawiono jako średnią i odchylenie standardowe, natomiast dane kategoryczne przedstawiono jako liczbowe i procentowe. Statystyki opisowe: obliczono średnie, odchylenia standardowe, mediany, zakresy i procenty. Test istotności: dla zmiennych ciągłych z więcej niż dwiema kategoriami; Test ANOVA został obliczony w celu zbadania średnich różnic danych, które są zgodne z rozkładem normalnym, a niezależna próba Kruskala-Wallisa została wykorzystana do porównania mediany różnicy między grupami, które nie mają rozkładu normalnego, test post-hoc został obliczony przy użyciu poprawek Bonferroniego. Zastosowano analizę korelacji (korelacja rankingowa Spearmana, dwustronna).

      Wartość p < 0,05 uznano za istotną.