Imunohistochemické hodnocení exprese proteinu P16 v nádorech ovariálních zárodečných buněk.

V této studii se snažíme:

1-Vyhodnoťte imunohistochemickou expresi p16 v neoplastické složce benigních a maligních OGCT a vyhodnoťte jeho imunoreaktivitu.

2-Korelujte mezi imunohistochemickou expresí P16 v MOGCT s indexem proliferace Ki 67 a stanovením FIGO.

1. Typ studie: Shodná případová-kontrolní studie.

2. Studijní předměty:

   1. Kritéria zařazení: Různé typy nádorů ze zárodečných buněk vaječníků, včetně: benigních (zralý cystický teratom) a maligních (dysgerminom, nezralý teratom a nádor ze žloutkového váčku).

   2. Kritéria vyloučení:

      Jakákoli kritéria, která nesplňují kritéria pro zařazení, jako jsou resekované nádory vaječníků jiné než nádory ze zárodečných buněk vaječníků, např. epiteliální nádory vaječníků, stromální nádory pohlavní šňůry nebo metastatické léze vaječníků.

      • Protokol studie byl schválen Institutional Review Board na Lékařské fakultě Univerzity Assiut v prosinci 2019 (IRB č. 17100871) a Etický souhlas pro tuto studii byl získán od komise pro lékařskou etiku Lékařské fakulty Univerzity Assiut.
      • Studijní prostředí: Laboratoř IHC Ústavu patologie, Lékařská fakulta, Assiut University.
      • Odběr vzorků tkáně: Od ledna 2010 do ledna 2021 bylo z oddělení chirurgické patologie v Assiut University Hospital (AUH) a South Egypt cancer institute (SECI) získáno 62 formalínem fixovaných, parafínových voskem zalitých vzorků vaječníků. Tyto vzorky zahrnují:

      (Skupina A) 22 maligních nádorů ze zárodečných buněk vaječníků (MOGCT), (Skupina B) 20 zjevně normální tkáně vaječníků jako kontrolní skupina a (Skupina C) 20 zralých cystických teratomů jako rovnocenná benigní srovnávací skupina.

      Skupinu A tvoří 5 dysgerminomů, 8 nezralých teratomů (čtyři z nich Grade II a další čtyři jsou Grade III, FIGO grading system) a 9 tumorů žloutkového váčku. Věk pacientů se pohyboval od 12 do 23 let (střední věk 16,5 let). Počáteční diagnóza každého MOGCT byla přehodnocena podle klasifikace ovariálních nádorů WHO.

      Skupina B zahrnuje normálně zjevné vaječníky, které byly chirurgicky resekovány pomocí vzorků totální abdominální hysterektomie a salpingo-oferktomie pro neovariální, nemaligní příčiny, jako je mnohočetná myoma dělohy a adenomyóza jako kontrolní skupina. Pacienti byli ve věku od 42 do 64 let (medián 50 let).

      Všechna dostupná sklíčka barvená hematoxylinem a eosinem byla vyšetřena dvěma nezávislými patology rutinní světelnou mikroskopií a nejreprezentativnější jeden nebo dva tkáňové bloky byly použity pro imunohistochemické barvení. Klinické a patologické údaje zahrnují věk, stupeň, stadium, recidivu lézí byly hodnoceny podle patologických zpráv.

      • Imunohistochemie: Vzorky tkáně byly fixovány formalínem, tkáňové bloky zalité v parafínu a byly skladovány při pokojové teplotě. Z vybraných reprezentativních tkáňových bloků byly nařezány tenké řezy o tloušťce 4 um, které byly naneseny na potažená sklíčka, udržovány v sušárně při 70 °C po dobu 25 minut, zbaveny parafinu promytím ve dvou nádobách xylenu po dobu 15 minut pro každou a rehydratovány přes sériová ředění (100%, 90%, 80%, 70%) alkoholu po dobu 5 minut v každém ředění. Poté byly řezy ošetřeny 3% peroxidem vodíku po dobu 10 minut, aby se zabránilo nespecifickému pozadí, a následně adekvátně čtyřikrát promyty PBS pufrem. Pro získání antigenu byla sklíčka uchovávána v citrátovém pufru (PH = 6) a autoklávována při 90 °C po dobu 15 minut a ponechána vychladnout na teplotu místnosti. Sklíčka byla 4krát adekvátně promyta PBS pufrem a tkáňové řezy byly inkubovány s primární protilátkou; p16INK4a Rekombinantní králičí monoklonální protilátka (RM267) (MA5-27905) v ředění 1:500 přes noc, následovaná inkubací se sekundární protilátkou; Polyvalentní polymer-HRP po dobu 10 minut pro každý krok, po kterém následuje adekvátní 4krát promytí pufrem PBS. Tkáně byly poté ošetřeny diaminobenzidinovým chromogenem (DAP-chromogen) pro vývoj hnědé barvy po dobu 10 minut. Poté byly řezy ošetřeny Mayerovým hematoxylinem jako kontrastním barvivem po dobu 2 minut.

      Pro řezy získané pouze z maligních případů jsme přidali další barvení Ki67 IHC, protože tkáňové řezy po deparfinizaci a blokování 3% peroxidázou vodíku byly inkubovány s primární protilátkou; protilátka Ki67 (DAKO), připravená k použití po dobu 20 minut, následovaná inkubací se sekundární protilátkou; Polyvalentní polymer-HRP po dobu 20 minut, následované působením diaminobenzidin chromogenu (DAP-chromogen) pro vývoj hnědé barvy po dobu 5 minut. Poté byly řezy ošetřeny Mayerovým hematoxylinem jako kontrastním barvivem po dobu 2 minut.

      Sklíčka byla promyta vodou z vodovodu, dehydratována sériovým ředěním alkoholu, promyta xylenem po krátkou dobu a upevněna pomocí DPX.

      Normální zdánlivé ovariální tkáně byly použity jako kontroly. Řezy z cervikálního nekeratinizovaného spinocelulárního karcinomu s blokovou expresí p16 byly použity jako pozitivní kontroly; a tkáňové sklíčka bez ošetření primární protilátkou sloužily jako negativní kontroly.

      -Imunohistochemické hodnocení: Pro barvení P16 IHC bylo vizuálně odhadnuto procento P16 pozitivních buněk a umístění pozitivních signálů (nukleárních nebo cytoplazmatických) pro neoplastické složky všech lézí. Německý semikvantitativní skórovací systém byl použit k vyhodnocení exprese P16, protože každému nádoru bude přiděleno skóre podle intenzity cytoplazmatického a nukleového barvení (žádné zbarvení = 0, slabé zbarvení = 1, mírné zbarvení = 2, silné zbarvení = 3 ) A rozsah obarvených buněk (0 % = 0, 1-10 % = 1, 11-50 % = 2, 51-80 % = 3, 81-100 % = 4). Konečné imunoreaktivní skóre bude stanoveno vynásobením skóre intenzity s rozsahem skóre pozitivity obarvených buněk, s minimálním skóre 0 a maximálním skóre 12 (skóre 0, 1,2,3,4,6,8, 9 a 12).

      Pro KI67 IHC barvení pouze pro maligní případy bylo hodnoceno procento nukleární pozitivity barvených buněk, bez ohledu na intenzitu barvení ve všech zkoumaných řezech (alespoň 1000 nádorových buněk bylo spočítáno na řez pro odhad KI indexu).

      -Statistická analýza: Data byla analyzována pomocí IBM-SPSS verze 24. Numerická data byla prezentována jako průměr a standardní odchylka, zatímco kategorická data byla prezentována jako počet a procenta. Popisná statistika: Byly vypočteny průměry, standardní odchylky, mediány, rozsahy a procenta. Test významnosti: pro spojité proměnné s více než dvěma kategoriemi; Test ANOVA byl vypočten pro testování středních rozdílů dat, která sledují normální distribuci a nezávislý vzorek Kruskal-Wallis byl použit pro srovnání středního rozdílu mezi skupinami, které nesledují normální distribuci, post-hoc test byl vypočten pomocí Bonferroniho korekcí. Byla použita korelační analýza (Spearmanova Ranked correlation, 2-tailed).

      Hodnota p < 0,05 byla považována za významnou.