Évaluation immunohistochimique de l'expression de la protéine P16 dans les tumeurs des cellules germinales ovariennes.

Dans cette étude, nous visons à :

1-Évaluer l'expression immunohistochimique de p16 dans le composant néoplasique des OGCT bénignes et malignes et marquer son immunoréactivité.

2-Corréler entre l'expression immunohistochimique de P16 dans les MOGCT avec l'indice de prolifération Ki 67 et le stade FIGO.

1. Type d'étude : Étude cas-témoin appariée.

2. Sujets d'étude :

   1. Critères d'inclusion : Différents types de tumeurs germinales de l'ovaire, notamment : bénignes (tératome kystique mature) et malignes (dysgerminome, tératome immature et tumeur du sac vitellin).

   2. Critère d'exclusion:

      Tous les critères qui ne remplissent pas les critères d'inclusion tels que les tumeurs ovariennes réséquées autres que les tumeurs des cellules germinales de l'ovaire, par exemple les tumeurs épithéliales de l'ovaire, les tumeurs des cordons sexuels et du stroma ou les lésions ovariennes métastatiques.

      • Le protocole d'étude a été approuvé par le Comité d'examen institutionnel de la Faculté de médecine de l'Université d'Assiut en décembre 2019 (IRB n°17100871) et l'approbation éthique de cette étude a été obtenue du comité d'éthique médicale de la Faculté de médecine de l'Université d'Assiut.
      • Cadre de l'étude : Laboratoire IHC du département de pathologie, Faculté de médecine, Université d'Assiut.
      • Échantillonnage de tissus : Soixante-deux échantillons d'ovaires fixés au formol et inclus dans de la paraffine ont été obtenus auprès des services de pathologie chirurgicale de l'hôpital universitaire d'Assiut (AUH) et de l'institut du cancer du sud de l'Égypte (SECI) de janvier 2010 à janvier 2021. Ces spécimens comprennent :

      (Groupe A) 22 tumeurs germinales ovariennes malignes (MOGCT), (Groupe B) 20 tissus ovariens normaux apparents comme groupe témoin et (Groupe C) 20 tératomes kystiques matures comme groupe de comparaison bénin égal.

      Le groupe A comprend 5 dysgerminomes, 8 tératomes immatures (quatre d'entre eux de grade II et les quatre autres sont de grade III, système de classification FIGO) et 9 tumeurs du sac vitellin. Les patients étaient âgés de 12 à 23 ans (âge médian 16,5 ans). Le diagnostic initial de chaque MOGCT a été réévalué selon la classification OMS des tumeurs ovariennes.

      Le groupe B comprend des ovaires normalement apparents qui ont été réséqués chirurgicalement avec des spécimens d'hystérectomie abdominale totale et de salpingo-opherctomie pour des causes non ovariennes et non malignes comme l'utérus à fibromes multiples et l'adénomyose en tant que groupe témoin. Les patients étaient âgés de 42 à 64 ans (médiane 50 ans).

      Toutes les lames colorées à l'hématoxyline et à l'éosine disponibles ont été examinées par deux pathologistes indépendants par microscopie optique de routine et le ou les deux blocs de tissu les plus représentatifs ont été utilisés pour la coloration immunohistochimique. Les données cliniques et pathologiques comprennent l'âge, le grade, le stade, la récurrence des lésions ont été évaluées selon les rapports pathologiques.

      • Immunohistochimie : les échantillons de tissus étaient des blocs de tissus fixés au formol et inclus en paraffine, et ont été conservés à température ambiante. Des sections minces de 4 um d'épaisseur ont été coupées à partir de blocs de tissus représentatifs sélectionnés, et ont été prises sur des lames enduites, conservées dans un four à 70-C pendant 25 minutes, déparaffinées par lavage dans deux récipients de xylène pendant 15 minutes pour chacun et réhydratées à travers dilutions en série (100 % , 90 % , 80 % , 70 %) d'alcool pendant 5 minutes dans chaque dilution. Ensuite, les coupes ont été traitées avec du peroxyde d'hydrogène à 3 % pendant 10 minutes pour éviter un bruit de fond non spécifique suivi d'un lavage au tampon PBS 4 fois de manière adéquate. Pour la récupération de l'antigène, les lames ont été conservées dans un tampon citrate (PH = 6) et autoclavées à 90-C pendant 15 minutes et laissées refroidir à température ambiante. Les lames ont été lavées avec du tampon PBS 4 fois de manière adéquate et les coupes de tissu ont été incubées avec l'anticorps primaire ; Anticorps monoclonal de lapin recombinant p16INK4a (RM267) (MA5-27905) à une dilution de 1:500 pendant la nuit, suivi d'une incubation avec un anticorps secondaire ; Polyvalent Polyvalent-HRP pendant 10 minutes pour chaque étape suivie de 4 fois adéquates de lavage tampon PBS. Les tissus ont ensuite été traités avec du chromogène diaminobenzidine (chromogène DAP) pour le développement de la couleur brune pendant 10 minutes. Ensuite, les coupes ont été traitées par l'hématoxyline de Mayer comme contre-coloration pendant 2 minutes.

      Pour les coupes reçues de cas malins uniquement, nous ajoutons une coloration IHC Ki67 supplémentaire car les coupes de tissu après déparaffinage et blocage par 3 % de peroxydase d'hydrogène ont été incubées avec l'anticorps primaire ; Anticorps Ki67 (DAKO), prêt à l'emploi pendant 20 minutes, suivi d'une incubation avec l'anticorps secondaire ; Polyvalent-HRP pendant 20 minutes, suivi d'un traitement avec le chromogène diaminobenzidine (chromogène DAP) pour le développement de la couleur brune pendant 5 minutes. Ensuite, les coupes ont été traitées par l'hématoxyline de Mayer comme contre-coloration pendant 2 minutes.

      Les lames ont été lavées à l'eau du robinet, déshydratées par des dilutions en série d'alcool, lavées au xylène pendant une courte période et montées avec du DPX.

      Les tissus ovariens apparents normaux ont été utilisés comme témoins. Des sections de carcinome épidermoïde non kératinisé du col de l'utérus avec expression de p16 en bloc ont été utilisées comme témoins positifs ; et les lames de tissu sans le traitement par anticorps primaire ont servi de témoins négatifs.

      -Évaluation immunohistochimique : Pour la coloration IHC P16, le pourcentage de cellules positives P16 et la localisation des signaux positifs (nucléaires ou cytoplasmiques) ont été estimés visuellement pour les composants néoplasiques de toutes les lésions. Le système de notation semi-quantitatif allemand a été utilisé pour évaluer l'expression de P16 car chaque tumeur recevra un score en fonction de l'intensité de la coloration cytoplasmique et nucléique (pas de coloration = 0, faible coloration = 1, coloration modérée = 2, forte coloration = 3 ) Et l'étendue des cellules colorées (0 % = 0, 1-10 % = 1, 11-50 % = 2, 51-80 % = 3, 81-100 % = 4). Le score immunoréactif final sera déterminé en multipliant les scores d'intensité par l'étendue des scores de positivité des cellules colorées, avec le score minimum de 0 et un score maximum de 12 (score 0, 1,2,3,4,6,8, 9 et 12).

      Pour la coloration KI67 IHC pour les cas malins uniquement, le pourcentage de cellules colorées de positivité nucléaire a été évalué, quelle que soit l'intensité de la coloration dans toutes les sections examinées (au moins 1000 cellules tumorales ont été comptées par section pour l'estimation de l'indice KI).

      -Analyse statistique : les données ont été analysées à l'aide d'IBM-SPSS version 24. Les données numériques ont été présentées sous forme de moyenne et d'écart-type, tandis que les données catégorielles ont été présentées sous forme de nombre et de pourcentage. Statistiques descriptives : les moyennes, les écarts-types, les médianes, les plages et les pourcentages ont été calculés. Test de significativité : pour les variables continues à plus de deux modalités ; Le test ANOVA a été calculé pour tester les différences moyennes des données qui suivent la distribution normale et l'échantillon indépendant Kruskal-Wallis a été utilisé pour comparer la différence médiane entre les groupes qui ne suivent pas la distribution normale, le test post-hoc a été calculé à l'aide des corrections de Bonferroni. Une analyse de corrélation a été utilisée (corrélation classée de Spearman, bilatérale).

      Une valeur de p < 0,05 était considérée comme significative.