Иммуногистохимическая оценка экспрессии белка Р16 в опухолях зародышевых клеток яичников.

В этом исследовании мы стремимся:

1-Оцените иммуногистохимическую экспрессию p16 в неопластическом компоненте доброкачественных и злокачественных OGCT и оценку его иммунореактивности.

2-Корреляция между иммуногистохимической экспрессией P16 в MOGCT с индексом пролиферации Ki 67 и стадией FIGO.

1. Тип исследования: Соответствующее исследование случай-контроль.

2. Предметы изучения:

   1. Критерии включения: различные типы герминогенных опухолей яичников, в том числе: доброкачественные (зрелая кистозная тератома) и злокачественные (дисгерминома, незрелая тератома и опухоль желточного мешка).

   2. Критерий исключения:

      Любые критерии, которые не соответствуют критериям включения, такие как резецированные опухоли яичников, отличные от опухолей зародышевых клеток яичников, например, эпителиальные опухоли яичников, стромальные опухоли полового тяжа или метастатические поражения яичников.

      • Протокол исследования был одобрен Институциональным наблюдательным советом медицинского факультета Университета Асьюта в декабре 2019 года (IRB № 17100871), а одобрение этического исследования для этого исследования было получено от комитета по медицинской этике медицинского факультета Университета Асьюта.
      • Место проведения исследования: лаборатория IHC отделения патологии медицинского факультета Университета Асьюта.
      • Образцы тканей: с января 2010 г. по январь 2021 г. в отделениях хирургической патологии Университетской больницы Асьюта (AUH) и Института рака Южного Египта (SECI) было получено 62 фиксированных формалином и залитых парафином образца яичников. Эти образцы включают в себя:

      (Группа A) 22 злокачественных герминогенных опухоли яичников (MOGCT), (Группа B) 20 кажущихся нормальными тканей яичников в качестве контрольной группы и (Группа C) 20 зрелых кистозных тератом в качестве равноценной доброкачественной группы сравнения.

      Группу А составляют 5 дисгермином, 8 незрелых тератом (четыре из них Grade II и остальные четыре Grade III по системе классификации FIGO) и 9 опухолей желточного мешка. Пациенты были в возрасте от 12 до 23 лет (медиана возраста 16,5 лет). Первоначальный диагноз каждой MOGCT был переоценен в соответствии с Классификацией ВОЗ опухолей яичников.

      Группа В включает в себя нормально видимые яичники, хирургически резецированные с образцами тотальной абдоминальной гистерэктомии и сальпингооферэктомии по неяичниковым, незлокачественным причинам, таким как множественная миома матки и аденомиоз, в качестве контрольной группы. Пациенты были в возрасте от 42 до 64 лет (медиана 50 лет).

      Все имеющиеся предметные стекла, окрашенные гематоксилином и эозином, были исследованы двумя независимыми патологоанатомами с помощью обычной световой микроскопии, и наиболее репрезентативные один или два блока тканей были использованы для иммуногистохимического окрашивания. Клинические и патологоанатомические данные включают возраст, степень, стадию, рецидивы поражений, которые оценивались в соответствии с патологоанатомическими отчетами.

      • Иммуногистохимия. Образцы тканей фиксировали формалином, блоки тканей заливали парафином и хранили при комнатной температуре. Тонкие срезы толщиной 4 мкм вырезали из выбранных репрезентативных блоков ткани и помещали на предметные стекла с покрытием, выдерживали в печи при 70°C в течение 25 минут, депарафинизировали промыванием в двух контейнерах с ксилолом в течение 15 минут для каждого и регидратировали через серийные разведения (100%, 90%, 80%, 70%) спирта по 5 минут в каждом разведении. Затем срезы обрабатывали 3% перекисью водорода в течение 10 минут для предотвращения неспецифического фона с последующим адекватным промыванием буфером PBS 4 раза. Для выделения антигена предметные стекла хранили в цитратном буфере (рН = 6), автоклавировали при 90°С в течение 15 минут и оставляли охлаждаться до комнатной температуры. Предметные стекла промывали буфером PBS 4 раза в достаточной степени и срезы тканей инкубировали с первичными антителами; рекомбинантное кроличье моноклональное антитело p16INK4a (RM267) (MA5-27905) в разведении 1:500 в течение ночи с последующей инкубацией со вторичным антителом; Поливалентный полимер-HRP в течение 10 минут для каждой стадии с последующей 4-кратной промывкой буфером PBS. Затем ткани обрабатывали диаминобензидиновым хромогеном (DAP-хромогеном) для развития коричневого цвета в течение 10 минут. Затем срезы обрабатывали гематоксилином Майера в качестве контрастного красителя в течение 2 минут.

      Для срезов, полученных только от злокачественных опухолей, мы добавляем дополнительное окрашивание Ki67 IHC, поскольку срезы тканей после депарфинизации и блокировки 3% пероксидазой водорода инкубировали с первичными антителами; антитело Ki67 (DAKO), готовое к использованию в течение 20 минут с последующей инкубацией со вторичным антителом; Поливалентный полимер-HRP в течение 20 минут с последующей обработкой диаминобензидиновым хромогеном (DAP-хромогеном) для развития коричневого цвета в течение 5 минут. Затем срезы обрабатывали гематоксилином Майера в качестве контрастного красителя в течение 2 минут.

      Предметные стекла промывали водопроводной водой, обезвоживали последовательными разведениями спирта, промывали ксилолом в течение короткого периода времени и заключали в DPX.

      Нормальные кажущиеся ткани яичников использовали в качестве контроля. Срезы некератинизированной плоскоклеточной карциномы шейки матки с блоком экспрессии p16 использовали в качестве положительных контролей; и предметные стекла тканей без первичной обработки антителами служили в качестве отрицательного контроля.

      - Иммуногистохимическая оценка: для окрашивания P16 IHC визуально оценивали процент положительных клеток P16 и расположение положительных сигналов (ядерных или цитоплазматических) для неопластических компонентов всех поражений. Для оценки экспрессии P16 использовалась немецкая полуколичественная система оценки, поскольку каждой опухоли будет присвоен балл в соответствии с интенсивностью цитоплазматического и нуклеинового окрашивания (отсутствие окрашивания = 0, слабое окрашивание = 1, умеренное окрашивание = 2, сильное окрашивание = 3). ) И степень окрашенных клеток (0% = 0, 1-10% = 1, 11-50% = 2, 51-80% = 3, 81-100% = 4). Окончательная иммунореактивная оценка будет определяться путем умножения оценок интенсивности на степень положительности окрашенных клеток с минимальной оценкой 0 и максимальной оценкой 12 (оценка 0, 1,2,3,4,6,8, 9 и 12).

      Для окрашивания KI67 IHC только для злокачественных случаев оценивали процент ядерно-положительных окрашенных клеток, независимо от интенсивности окрашивания во всех исследованных срезах (для оценки индекса KI подсчитывали не менее 1000 опухолевых клеток на срез).

      -Статистический анализ: данные были проанализированы с использованием IBM-SPSS версии 24. Числовые данные были представлены в виде среднего значения и стандартного отклонения, а категориальные данные были представлены в виде числа и процента. Описательная статистика: рассчитывались средние значения, стандартные отклонения, медианы, диапазоны и проценты. Проверка значимости: для непрерывных переменных с более чем двумя категориями; Тест ANOVA был рассчитан для проверки средних различий данных, которые следуют нормальному распределению, а независимая выборка Крускала-Уоллиса использовалась для сравнения средней разницы между группами, которые не следуют нормальному распределению, апостериорный критерий был рассчитан с использованием поправок Бонферрони. Использовался корреляционный анализ (ранговая корреляция Спирмена, двусторонняя).

      Значение p <0,05 считалось значимым.